[发明专利]基于人TMPD1和HMGB1 A box的重组融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术、生物药物领域，具体地，本发明涉及高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box-1，HMGB1)中的A box结构域(HMGB1 A box)和血栓调节蛋白(Thrombomodulin TM)中的PD1(TMPD1)结构域组成的抗炎融合分子，及其制备方法。

背景技术

感染引起的败血症导致多器官功能衰竭，死亡率高达30％～50％，积极有效的抗炎措施是降低死亡率的必要条件。HMGB1是近年发现的一种重要的致炎因子。当其从胞内被释放到胞外后，便可通过较持久地刺激多种致炎因子的大量释放而发挥其极强的致炎作用，从而其在局部和全身性炎症及毒性综合征的发生过程中起着至关重要的作用。

目前，HMGB1作为关键致炎因子的主要证据有：(1)HMGB1及其B box可刺激单核/巨噬细胞、嗜中性粒细胞释放TNFα等多种致炎因子，极低浓度的HMGB1即可活化巨噬细胞，提示HMGB1可能是TNFα释放最重要的内源性刺激因子。(2)HMGB1广泛表达于多种细胞。因此，除了感染激活的免疫细胞可释放HMGB1外，因缺血、创伤、烧伤等因素造成的其它受损或坏死体细胞也可大量释放HMGB1(已有实验表明，在HMGB1敲除小鼠，其细胞裂解物较野生型细胞裂解物的致炎能力大大降低)，可见HMGB1的来源广泛。其这种来源的广泛性，将感染和非感染性因素造成的炎症反应整合到了一起，从而在很大程度上合理解释了为什么感染和非感染性机制导致的系统性炎症最终都发展为临床症状相似的毒性综合征。(3)经HMGB1处理而死亡的小鼠，其组织病理学检查发现很少有重要器官的组织发生坏死，这同很多死于毒性综合征的病人的尸检结果相一致。其机制可能是HMGB1使得上皮细胞不能保持紧密连接，从而导致了广泛性的上皮功能障碍，结果使得体液和电解质移位，无法维持细胞间的体液和电解质以及能量梯度的平衡，最终导致机体死亡。(4)动物实验表明，HMGB1的抑制剂对全身性炎症及毒性综合征有良好的防治作用，能显著增加动物存活率；即使在发病24小时后给予HMGB1的抑制剂，仍可有效地发挥治疗作用，也就是说针对HMGB1的治疗窗口期可达≥24小时。可见，针对HMGB1的抗炎措施在临床上的可操作性更强。

近年研究表明(The Journal of Clinical Investigation，2005 115：1267-1274)，TM可通过PD1结构域结合并中和关键致炎因子HMGB1的作用，产生直接的、明显的抗炎效应。Kazuhiro等发现，TMPD1有明确的抗炎功能，此结构域与HMGB1受体竞争结合HMGB1 B box，在体外实验中，阻止白细胞的活化，抑制NF-κB信号通路，抑制TNFα、IL-1、IL-8等炎症因子的释放；对小鼠进行的动物实验发现，TMPD1可明显缓解紫外线引起的皮肤炎症，并降低LPS导致的死亡率。

发明内容

鉴于HMGB1 A box是一个只有85个氨基酸残基组成的短肽，在细菌中的表达欠稳定性，且TMPD1也具有此特点，本发明旨在将TMPD1基因和HMGB1A box编码序列融合，以获得具有双重抑制HMGB1的且稳定性更好的融合蛋白，该融合蛋白作为HMGB1的新型抑制剂，在其作用下，可以实现对HMGB1信号通路的高效阻断。

本发明所述的基于人TMPD1和HMGB1 A box的重组融合蛋白，具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列；具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明还提供上述的基于人TMPD1和HMGB1 A box的重组融合蛋白的制备方法，主要包含以下步骤：

1)提取人外周血单核细胞的总RNA并将其反转录为cDNA；

2)以步骤1)中的cDNA为模板，使用SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列为引物扩增人TMPD1的cDNA；

3)以步骤1)中的cDNA为模板，使用SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列为引物扩增人HMGB1 A box的cDNA；

4)将步骤2)获得的人TMPD1的cDNA和步骤3)获得的人HMGB1 A box的cDNA分别酶切后与载体连接；

5)将步骤4)所得连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得包含人HMGB1A box/限制性内切酶位点/TMPD1的重组载体；

6)用步骤5)重组载体为模板，经反向PCR，在缺失限制性内切酶位点编码序列的同时，将人HMGB1 A box与TMPD1的编码序列直接相连；