[发明专利]云南高原湖泊中铜绿微囊藻噬藻体尾鞘蛋白编码基因g91核酸序列及其制备方法和其应用

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及从云南高原淡水湖泊中得到的5条铜绿微囊藻噬藻体尾鞘蛋白编码基因g91核酸序列以及制备这些基因序列的方法和其在滇池及云南高原淡水湖泊中铜绿微囊藻噬藻体分子水平的检测、发现新型高毒力噬藻体、高原湖泊蓝藻生物防治中的应用。 

背景技术：

云南九大高原湖泊流域面积近8000km²，分属金沙江、澜沧江～湄公河和珠江三大水系，随着湖区经济的发展、人口的增长以及人为活动的加剧，面临的环境问题尤其是水环境污染问题愈显突出，湖泊水环境污染状况令人担忧。滇池作为云南高原淡水湖泊之首，湖面近300多平方公里，湖岸线长约150公里，北部的海堤将湖分为外海和草海两部分。盘龙江等河流携带大量泥沙沉积淤浅和各类污水废水流入滇池。滇池地区，夏季受西南季风控制，空气湿度显著增加，温度日夜变幅小，没有显著的春夏秋冬之分，只有干季与湿季的差别。年平均气温在14.5～17.8℃之间。水体富营养化的加速阶段始自20世纪80年代初，90年代迅速恶化，滇池水质从III类下降到劣V类。入湖污染物不断增加，富营养化日趋严重，导致湖内蓝藻大量繁殖，1992年蓝藻水华首次大面积暴发，从此，滇池蓝藻水华问题日益严重。近年来，滇池湖水水质已降至劣五类，严重影响城市供水和湖泊生态环境。另外，云南境内的杞麓湖、异龙湖、星云湖等高原淡水自然湖泊也都面临着与滇池类似的水体富营养化问题。 

滇池外海水域每年爆发的“水华”现象，就是以微囊藻为优势种的藻类大量繁殖所致，其中尤以铜绿微囊藻在数量和发生频率上占绝对优势。微囊藻呈全球性分布。它们是在富营养化湖泊中形成“水华”进而对生态环境造成严重影响的主要藻 类。国内外许多湖泊均因该藻的大量繁殖形成水华而造成大面积的水体生态破坏。铜绿微囊藻适应温度范围宽，对高温具有良好的适应性，并且光合作用随温度的升高显著提高；光饱和点低，光合作用活性高，能在弱光环境中高效地进行光合作用，并且抗强光伤害；对pH变化具有超强的适应能力，在中性和碱性环境中，都能进行活跃的光合作用。铜绿微囊藻在光能利用、温度和pH适应性方面的特点，可以使其快速生长繁殖，积累大量的生物量，在与其它藻类的竞争中占据显著的优势。有研究显示，滇池中水华蓝藻总数为3.445×10⁶～1.081×10⁹L^-1，微囊藻属的数量为3.445×10⁶～1.031×10⁹L^-1，是滇池浮游植物群落的单优势属。水华蓝藻数量的时空分布与微囊藻属一致，7月最高，1月最低；近岸带高于湖心，湖北部高于湖中部高于南部；束丝藻属的数量3月最高，1月最低；湖北部高于南部高于中部。微囊藻水华全年可见，束丝藻属仅在3月形成零星的小面积水华。 

噬藻体既蓝藻病毒在海洋与淡水中均广泛存在，并且其含量在蓝藻水华生消前后变化明显，具有重要生态作用。上世纪九十年代，噬藻体分子生物学的研究对象主要局限于对海洋噬藻体的衣壳组装蛋白基因进行病毒检测、生态分布和遗传多样性分析。进入21世纪以来，淡水噬藻体研究也得到了相应重视，Takashima等人根据感染有毒铜绿微囊藻的Ma-LMM01衣壳蛋白编码基因g91设计的实时定量PCR引物，对铜绿微囊藻水华发生前后水体中的Ma-LMM01进行定量分析，为噬藻体对铜绿微藻水华的生态影响提供了新方法。Yoshida等人通过此方法还检测到日本Mikata湖中铜绿微囊藻消退时噬藻体数量有明显增加，而且噬藻体对产毒铜绿微藻和非产铜绿微藻数量有调节作用。然而，迄今为止，还没有对水体污染严重的云南滇池以及周边高原淡水湖泊水体中铜绿微囊藻噬藻体尾鞘蛋白编码基因g91核酸序列的报道，也没有其获得方法和其应用的报道。 

发明内容：

本发明利用铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMM01的g91基因片段设计了两对巢式PCR 引物。对云南滇池以及周边高原淡水湖泊水样利进行巢式PCR特异性扩增，胶回收和测序分析得到如权利要求1中所述的5条DNA核苷酸序列。如权利要求1中所述的5条DNA核苷酸序列之间仅存在个别核苷酸差异，保守性极高，可作为云南高原淡水湖泊中铜绿微囊藻噬藻体分子水平的检测标准。进化树分析表明其与已有报道的铜绿微囊藻噬藻体有极高同源相关性。同时提供制备这些基因序列的方法和其在滇池及云南高原淡水湖泊中铜绿微囊藻噬藻体分子水平的检测标准、发现新型高毒力噬藻体、高原湖泊蓝藻生物防治中的应用。 

本发明用下面的技术方案来实现上述的发明目的：