[发明专利]一种在滇紫草细胞培养过程中增强紫草素合成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过添加多聚物来促进滇紫草细胞培养过程中增强紫草素合成的方法。

背景技术

滇紫草(Onosma paniculatum Bur.et Fr.)主产云南，是云南省本地常用中草药，属紫草科(Boraginaceae)植物，其根药用。主要有效成分为紫草素及其衍生物，这些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，而且还作为天然色素广泛用于医药、化妆品和印染工业。目前，滇紫草的野生资源破坏严重，市场上供需矛盾凸显。而利用植物细胞大规模培养技术在反应器中直接培养细胞获得药用次生代谢产物是将来生产植物药最直接、最有效的手段。而对于开展细胞培养技术来生产药用次生代谢产物，获得一种能显著促进次生代谢物合成的方法，是保证高生产效率，缩短生长周期，降低生产成本的有效手段。

随着植物细胞离体培养技术的不断改进和革新，发现了越来越多的生物或非生物的胁迫因子对植物次生代谢过程产生影响，而这些影响结果有不是积极的，是与培养目标相一致的。紫草素作为典型的植物次生代谢产物，已有报道表明多种物质能提高滇紫草培养细胞中紫草素含量，如某些真菌提取物可以提高滇紫草培养过程中的紫草素含量一倍左右(宁文等，植物生理学报，1994，20(4)：325-331)；油菜素内酯添加到培养基，可以提高滇紫草细胞紫草素含量70％以上(张华等，南京大学学报，1999，35(2)：151-155.)；甲基茉莉酮酸酯配合植物激素作用，可以显著提高细胞中紫草素的合成量(Ding et al.In VitroCell Dev-PL，2004，40：581-585)。综合上述，发现更多、更有效的刺激因子来高植物药用次生代谢产物的含量是行之有效的技术手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过添加多聚物—壳聚糖来促进滇紫草细胞培养过程中增强紫草素合成的方法。

该方法的操作步骤如下：

1)滇紫草细胞的继代培养：继代培养基为：MS基础培养基+NAA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25±1℃，避光培养；

2)合成培养基的配制及紫草素合成阶段的细胞培养：M10固体培养基+壳聚糖，壳聚糖加入量为每升M10培养基5-50mg，M10培养基的成分如表1所示；壳聚糖的种类为分子量60000的壳聚糖、分子量90000的壳聚糖、分子量400000的壳聚糖中的一种。在装有40mL固体培养基的三角瓶中进行，采用继代培养15天的细胞接种，培养温度为25±1℃，pH值5.6，暗培养，该紫草素合成阶段的细胞培养周期为15天。

表1  M10培养基成分

3)紫草素含量的测定：将培养的滇紫草细胞转移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸点30—60℃)，用超声细胞破碎仪进行细胞破碎，然后在室温下振荡(110r/min)提取24h，提取液用于测定细胞中紫草素的含量。

紫草素呈红棕色，用分光光度计测量，在520nm处有最大吸收峰。绘制标准曲线，得到C＝187.85X—2.09，r＝0.9995，其中C为石油醚溶液中的紫草素浓度(mg/L)，X为该测定溶液的吸光度值。

S＝(CNV/W)×100％；

其中，S为紫草素含量(％)，W为愈伤组织干重(mg)，V为萃取液体积(L)，N为稀释倍数。

本发明的关键点在于：1.所添加壳聚糖的分子量；2.添加壳聚糖的浓度。以上关键点如能把握好，可以显著提高细胞紫草素的含量。

本发明操作简便，效果良好，本发明可应用到植物细胞大规模培养生产有用次生代谢产物的实际生产过程中。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。

实施例1：

1)滇紫草细胞的继代培养：继代培养基为：MS基础培养基+NAA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25±1℃，避光培养；

2)将继代培养15天的滇紫草细胞接种在合成培养基中培养，培养基成分为：M10固体培养基+分子量为60000的壳聚糖(用量见表2)，pH值5.6，培养温度为25±1℃，避光培养，培养周期为15天。

3)培养结束后测定细胞紫草素的含量，其结果见表2。

表2  不同浓度的壳聚糖(分子量60000)对滇紫草细胞紫草素含量的影响

注：对照组为不添加壳聚糖的实验组。

实施例2：