[发明专利]将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法

说明书

技术领域

由于人羊膜间充质细胞(human Amnion mesenchymal cells，hAMCs)具有增殖活性和多分化潜能等干细胞生物学特点，本发明涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法。

背景技术

血管内皮细胞是组织工程化血管的核心，是血管外科和心脏外科血管移植物的主要材料。目前研究利用各种间充质细胞进行诱导分化取得了很大进展。Joachim等采用密度梯度法分离人MSCs，加入2％胎牛血清和50μg/L血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)诱导7d，发现诱导前后细胞没有明显的形态学改变，但免疫组织化学提示VIII因子抗体有显著的升高，电镜可以发现Weibel 2 Palade小体(W2P小体)。同时，细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、VFGF受体KDR/Flt21、血管内皮黏附分子及血管细胞黏附分子1。在半固体培养基中还可以形成血管腔样结构。诱导后的细胞呈梭形，传代超过5代后细胞即变宽、变平，故有关内皮细胞的研究应在第1～5代之间进行。Liang等应用VEGF和碱性成纤维生长因子诱导后发现，细胞形成血管腔样结构，周围有呈铺路石样排列的内皮样细胞。兔抗VEGF受体1(Flt21)最早阳性表达，随后CD34、CD31、Flt21、VIII因子抗体也阳性表达并呈逐渐增加的趋势。Gang等则提取脐血MSCs经VEGF、表皮生长因子和皮质醇激素诱导3周，同样诱导出具有内皮细胞表面标记的细胞，并发现有一些细胞因子分泌。

而人羊膜间充质细胞作为一种多潜能细胞，由于微环境中的细胞因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进间充质细胞向不同的谱系细胞分化。来源于绒毛膜、羊膜和绒毛间质的间充质细胞在体外可以自发分化形成血管内皮细胞，加入血管内皮生长因子(VEGF)可以促进这一过程，人羊膜组织表达VEGF受体-1和2，经VEGF刺激后表达的内皮特异性标志FLT-1、KDR和ICAM增加，并且出现CD34(+)血管源性假血友病因子阳性细胞，研究报道，人羊膜间充质细胞移植可以治疗心肌梗塞动物模型，改善心肌缺血状况。

发明内容

本申请的发明目的在于提供一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法。

为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，它包括：

(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；

(2)清洗上述人羊膜组织；

(3)消化清洗后的人羊膜组织；

(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/ml-2×10⁶个/ml；

其中：

(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入含有10％FBS、1×10⁵IU/L青-链霉素、10μg/LVEGF和2μg/L bFGF的M-199内皮细胞诱导培养基，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁵个/ml，然后将其接种至24孔板中，每两天更换上述培养基一次，诱导14天后，得到血管内皮样细胞；

(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行免疫荧光染色鉴定，检测得到的细胞是否为血管内皮样细胞；

本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织；

本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用D-hank’s液清洗3-5遍；