[发明专利]将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法

权利要求书

1.一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，它包括：

(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；

(2)清洗上述人羊膜组织；

(3)消化清洗后的人羊膜组织；

(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/ml-2×10⁶个/ml；

其特征在于：

(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入含有10％FBS、1×10⁵IU/L青-链霉素、10μg/LVEGF和2μg/L bFGF的M-199内皮细胞诱导培养基，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁵个/ml，然后将其接种到至少一个24孔板中，每两天更换上述培养基一次，诱导14天后，得到血管内皮样细胞；

(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行免疫荧光染色或透射电镜鉴定，检测得到的细胞是否为血管内皮样细胞。

2.如权利要求1所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织。

3.如权利要求2所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用D-hank’s液清洗3-5遍。

4.如权利要求3所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶的消化液，放入37℃水浴锅中分两次共消化45分钟后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10％FBS的DMEM/F12液终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s液清洗直至清洗液澄清为止。

5.如权利要求4所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征在于：所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充分地消化。

6.如权利要求5所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤：

(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；

(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬浊液；

(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10％FBS和DMEM/F12培养液后，用吸管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×10⁶个/ml-2×10⁶个/ml。