[发明专利]一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用。

背景技术

布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)，前者通过检疫扑杀患病牛、羊、猪等动物为措施，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患病动物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健康，阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。

根据现在国际上及我国的使用来看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱毒活疫苗，但S19的毒力强，接种母畜易引起流产，利用血清学方法不能与野生菌株感染区分；而RB51的毒力相对较弱，虽然能够进行血清学的鉴别诊断，但RB51的免疫效力备受争议，在我国也没有使用。所以安全标记疫苗菌株是现在世界各国对于布鲁氏菌病防控的技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的提供一种流产布鲁氏菌重组菌及其在制备疫苗中的应用。

本发明提供的重组菌株，是将是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株S19中的荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因灭活得到的菌株。

所述流产布鲁氏菌菌株S19为现有流产布鲁氏菌疫苗株。

所述荚膜多糖合成蛋白可为任何来源于流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的荚膜多糖合成蛋白，具体可为序列表的序列1所示的荚膜多糖合成蛋白。所述荚膜多糖合成蛋白的编码序列具体可为序列表的序列2所示的核苷酸序列。

所述羧基尿苷磷酸脱羧酶可为任何来源于流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的羧基尿苷磷酸脱羧酶，具体可为序列表的序列3所示的羧基尿苷磷酸脱羧酶。所述羧基尿苷磷酸脱羧酶的编码序列具体可为序列表的序列4所示的核苷酸序列。

可通过任何现有方法灭活所述荚膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脱羧酶基因，如基因组中该序列缺失、外源或内源序列插入、同源重组、RNA干扰等。

灭活荚膜多糖合成蛋白基因的同源重组可通过将DNA片段DA15导入流产布鲁氏菌菌株S19实现；所述DNA片段DA15自上游至下游依次为同源臂DA15-1和同源臂DA15-2；所述同源臂DA15-1和同源臂DA15-2能与所述菌株基因组中的荚膜多糖合成蛋白编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述荚膜多糖合成蛋白基因。

所述同源臂DA15-1和同源臂DA15-2的长度均为400-600bp。

所述同源臂DA15-1具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO397(上游引物)：5’-GGAATTCTCAATGTAACCAACTTCA-3’(序列表的序列5)；

pWUO398(下游引物)：5’-AAGCTTAGAGGTCATACCTTCCTG-3’(序列表的序列6)。

所述同源臂DA15-2具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO399(上游引物)：5’-CCTCTAAGCTTATCTGTTTGCTGATGCG-3’(序列表的序列7)；

pWUO400(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTTTCGGATAAGATG-3’(序列表的序列8)。

灭活羧基尿苷磷酸脱羧酶基因的同源重组可通过将DNA片段DAT导入流产布鲁氏菌菌株S19实现；所述DNA片段DAT自上游至下游依次为同源臂DAT-1和同源臂DAT-2；所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2能与所述菌株基因组中羧基尿苷磷酸脱羧酶编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述羧基尿苷磷酸脱羧酶基因。

所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2的长度均为400-600bp。

所述同源臂DAT-1具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO659(上游引物)：5’-GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3’(序列表的序列9)；

pWUO660(下游引物)：5’-AAGCTTCGTCATCGTGCAATTCTG-3’(序列表的序列10)。