[发明专利]支持HCV 1b亚基因组复制的体外细胞模型的建立

说明书

技术领域

本发明成功建立了支持中国人群HCV 1b亚基因组复制子高效复制的体外细胞模型，为HCV致病机制、治疗药物筛选和评价等方面的研究打下了基础。具体地说，本发明涉及针对中国人群的HCV 1b亚型亚基因复制子的细胞模型的构建工艺，包括体外转录HCV 1b亚基因组复制子RNA和体外电穿孔技术将HCV 1b亚基因组复制子RNA转染到Huh-7.5.1细胞系中，涉及使用RT-PCR技术和Western Blot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，以及通过Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数。涉及该模型在未来的抗HCV药物筛选和评价中的医学应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是丙型肝炎的致病体，丙型肝炎是世界范围内的重要传染病之一。据估计，目前，世界上有1.7亿多人感染该病毒，占人口总数的3％，并呈上升趋势，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例^[1]，我国HCV感染率达到3.2％，估计有四千万HCV感染者。成人感染HCV后，约50％-80％发展成慢性丙型肝炎，其中约20％可发展成肝硬化，肝硬化患者中，每年约1％-4％可发展为肝癌^[2]，所以丙型肝炎成为全球性严重危害人民健康的疾病。目前对HCV的预防和治疗十分有限，迄今还没有疫苗问世。HCV感染者最有效的治疗方法为聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，持续病毒学应答率可达54％～56％，但该疗法对基因型有很强的依赖性，即不同的基因型对治疗反应差异很大。此外，其治疗费用颇高，且具有显著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治疗方法。

HCV发病机制的研究，抗病毒药物筛选和疫苗研制都离不开有效的体外细胞模型。长期以来各国研究人员都在尝试建立HCV 1b亚型的体外细胞复制和感染模型，对于HCV 1b亚型，细胞模型的发展主要经历了人淋巴细胞模型、肝细胞培养模型、HCV复制子转染细胞模型三个阶段。由于前两种模型普遍存在着细胞系维持时间短，病毒复制水平低等缺陷，极大的限制了它们的应用价值。而随着分子生物学的迅猛发展，HCV复制子转染细胞模型慢慢成为了广大科研工作者的研究重点。直到1999年，Lohmann^[3]建立了在肝癌细胞中可以高水平自主复制的亚基因组复制模型，为HCV致病机制研究及抗病毒药物评价提供了一个新的途径。但是其缺点是细胞的转染效率比较低。

发明内容

本发明是研究建立我国人群中居多的HCV 1b亚型亚基因组复制子细胞模型，提高HCV亚基因组复制子的转染效率。

本发明克隆了中国人群中HCV感染者的亚基因组cDNA并构建了具有药物筛选标签的质粒，采用体外转录的方法获得HCV 1b亚型亚基因组复制子RNA，并通过电穿孔的方法转染入细胞系Huh-7.5.1^[4]中，经过G418药物筛选6周后，获得了大量高效复制HCV 1b亚型亚基因组复制子的细胞集落。在此工作基础上，为了筛选到具有稳定遗传和高效复制的细胞单克隆，我们在获得的细胞集落中，挑去90个单克隆进行单克隆化培养，最终得到三个具有稳定遗传和高效复制的细胞单克隆。本发明的目的在于为未来的HCV机制研究，抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具。本发明研究运用RT-PCR技术和Western Blot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，并且通过Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数。证实了细胞模型中存在HCV 1b亚型亚基因组复制子，并且有大量的拷贝数。

与此同时，本发明采用干扰素-α处理细胞模型，确定细胞中HCV亚基因组复制子的拷贝数明显下降。进一步证实了细胞模型中存在HCV 1b亚型亚基因组复制子，并模拟了药物筛选的过程，为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。

小结：本发明涉及建立我国人群中居多的HCV 1b亚型亚基因组复制子细胞模型，通过RT-PCR技术和Western Blot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，并且通过Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数。证实了细胞模型中存在HCV 1b亚型亚基因组复制子，并且有大量的拷贝数。并且采用干扰素-α处理细胞模型，模拟了药物筛选的过程，为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。

本发明的主要技术特征在于：

(1)该细胞模型是针对我国人群中居多的HCV 1b亚型，具有中国的地方特色，为研究和治疗我国丙型肝炎感染者打下基础。