[发明专利]一种融合菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合菌株及其应用。

背景技术

豆科植物中的紫花苜蓿被称为牧草之王，随着生态农业发展和产业结构的调整，以及国内外牧草产品市场需求的拉动，以紫花苜蓿为主的牧草种植呈现迅速发展的态势，并逐步向规模化、集约化的方向发展。但紫花苜蓿生产中存在的两个问题在一定程度上严重制约了其产量和品质的提高。其一是由于根瘤菌与其宿主间的共生有效性，筛选适宜的根瘤菌菌株接种苜蓿品种，才能获得更佳固氮效果。其二是由于苜蓿镰刀菌根腐病(Fusarium spp.)造成苜蓿根系及主根腐烂，较为严重地影响了苜蓿生产。研究结果表明，由于草地本身的特点及经济、环境和食品安全等因素，严重制约了化学农药的使用。同时采用化学防治的方法无法有效的控制土传苜蓿病害的发生(Leath，et.al.1971)。生物控制剂(BCA)以其低毒、具有在作物幼苗根际建群的能力，持效期长，有害生物不易对其产生抗药性等特点得到广泛的关注和重视，目前国际上先进的农化公司大多积极参与生物控制剂的研究和市场化，特别是有益细菌在土传和种传病害的防治中已取得了一定进展，并有系列产品得到成功的应用，取得了显著的经济和生态效益。其中芽孢杆菌属(Bacillus spp)以其分布广，易分离培养，能产生耐热耐干燥的内生孢子，贮藏期长，使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物。芽孢杆菌属的生物防治作用在苜蓿病害防治中将扮演越来越重要的角色。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451是从黑龙江克山县大豆田间土壤中分离得到的一株具有广谱杀菌活性的生防菌株，该菌株用作土壤消毒和种子处理对土传和种传病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。2001～2002年期间在黑龙江省大豆重迎茬田、吉林省和北京郊区根腐病发生比较严重的多个蔬菜保护地和苜蓿田进行的防治试验结果表明HL259及其代谢产物能够显著的防治由Pythium，Phytophthora，Fusarium等引起的烂种、猝倒、立枯和根腐等病害，并兼治部分细菌性病害，具有一定的增产作用，是一株理想的土传病菌生物控制菌株，在以苜蓿为代表的牧草病害防治中将发挥重要作用。

原生质体融合即细胞融合，是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。通常用酶或机械的方法除去细胞壁，制成原生质然后用物理、化学或生物学的方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子(Pathak et al.，1971；施巧琴等，2003)。

近年来，该技术已成为细胞生物学研究领域迅速发展的方向之一。1919年Giaja用蜗牛胃液从酵母细胞分离得到原生质，特别是1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分离Bacillus的原生质体，为微生物原生质体研究的发展奠定了基础。自Fodoret al.(1976)和Schaeffer et al.(1978)分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质体融合现象得到证实，并建立起了相应的试验体系。从此，原生质体融合育种广泛的应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内株间发展到种内种间，打破了种属间的亲缘关系，实现了属间、门间甚至跨界融合。

近30年来，由于研究方法的日渐改进和研究手段的不断更新，围绕着原生质体的研究，已经形成了一整套的原生质体技术，这些技术的日益成熟和发展，使人们对微生物原生质体的研究进入到了一个崭新的阶段(孙剑秋等，2002)。实践证明，利用原生质体融合技术可以获得具有双亲优良特性的融合子，如1999年清华大学余荔华等将克氏固氮菌和枯草芽孢杆菌进行了原生质体融合，并在室内测定了融合子的生物学性状、生理生化性状以及固氮活性；2002年西北农林科技大学韦革宏等展开苜蓿中华根瘤菌和鹰嘴豆慢生根瘤菌进行原生质体融合相关研究；同年，山东大学金玉娟以及首都师范大学黄勤妮分别进行了芽孢杆菌和欧文氏菌以及大肠杆菌和枯草芽孢杆菌之间原生质体融合的研究。细菌之间的原生质体融合可以克服细菌种属间的差异而实现基因重组。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合菌株及其应用。