[发明专利]一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种树突状细胞及其制备方法与专用培养基，特别涉及一种免疫耐受 型树突状细胞及其制备方法与专用培养基。

背景技术

树突状细胞(dendritic cell，DC)是一种最重要的抗原提呈细胞，因其成熟时伸 出许多树突样或伪足样突起而得名。其参与抗原的识别、加工处理和提呈，是机体免 疫的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特而重要的作用，能激活T细胞及抗原特异 性杀伤性T细胞，在抗肿瘤以及微生物免疫应答中发挥重要作用。近几年来DC相关研 究已逐渐成为免疫学中一个不断升温的热点，有关DC的基础研究与临床应用越来越受 到重视。早期研究DC时由于对其来源、分化发育和成熟等方面缺乏了解，只能从不同 的组织中分离DC，这样获得的细胞数量极少，且大大限制了对其功能特征的研究。目 前经体外诱导获得DC主要包括两种来源，即外周血单核细胞和造血干细胞(包括骨髓 和脐血)。脐血因其来源方便，免疫原性弱，含有大量造血干细胞，因而成为诱导DC 的最佳侯选细胞。有研究表明，经脐血CD34⁺造血干细胞诱导出的DC纯度更高，功能更 强大。不同的DC细胞群在免疫反应中发挥不同，甚至相反的作用。常规诱导方法诱导 的DC具有刺激机体免疫反应，杀伤病原体及肿瘤细胞的作用。近年研究发现，在抑制 性细胞因子IL-10诱导下的DC(Alternatively Activated Dendritic Cells，AADC) 是一种具有选择性免疫调节活性的树突状细胞，通过分泌抑制性细胞因子，降低炎性 因子的分泌及成血管作用，引起机体免疫产生耐受，减轻炎症作用，与传统DC具有截 然相反的功能，在自身免疫性疾病的治疗中有着非常广阔的应用前景。

间充质干细胞最早自骨髓中分离获得，是一类来源于中胚层的具有多向分化潜能 和自我更新能力的组织干细胞，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、 神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力，是骨髓造血微环境中多种基 质细胞的前体。最新的研究表明间充质干细胞能够分泌IL-6、IL-12、PGE2、IL-10等 免疫抑制性细胞因子，在基础及临床应用中都具有明显的减轻免疫反应作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基。

本发明提供的一种免疫耐受型树突状细胞的专用培养基，是在树突状细胞的培养 基中加入作为滋养层的间充质干细胞。

所述树突状细胞的培养基是：含有5％-15％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM-LG 培养基或胎牛血清浓度为5％-15％(体积百分含量)的完全1640培养基。

其中，所述间充质干细胞来源于人骨髓或商业化的人间充质干细胞株系。

本发明的另一目的在于提供一种免疫耐受型树突状细胞的制备方法，往上述的免 疫耐受型树突状细胞的专用培养基中，加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子，来制 备免疫耐受型树突状细胞。

其中，所述间充质干细胞与树突状细胞的前体细胞共培养比例是(1-2)∶(1-10)； 优选为1∶1。

所述树突状细胞的前体细胞来自人脐血或商业化的树突状细胞的前体细胞株系； 所述树突状细胞的前体细胞为CD34⁺细胞。

上述诱导因子为GM-CSF、TNF-α、IL-4和LPS。

其中，所述GM-CSF的浓度为10ng-100ng/ml，优选为10-30ng/ml；所述TNF-α的 浓度为10ng-100ng/ml，优选为10-30ng/ml；所述IL-4的浓度为10ng-100ng/ml，优选 为10-30ng/ml；所述LPS的浓度为10ng-1000ng/ml，优选为100-1000ng/ml；其中， GM-CSF和TNF-α在加入树突状细胞的前体细胞的第1天加入培养基，IL-4在第6天 加入培养基，LPS在第12天加入培养基。

上述培养的温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、湿度为饱和湿 度、培养时间是14天；所述温度优选为37℃、所述CO₂浓度优选为5％。

所述培养从开始起每3天换一次新鲜的所述培养基。

所述培养还包括继代培养。

本发明的又一目的在于提供按照上述制备方法所获得的免疫耐受型树突状细胞。