[发明专利]利用内生真菌诱导子促进白桦悬浮细胞中三萜积累的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种提高白桦悬浮细胞中三萜含量的实用技术，它属于生物工 程技术领域。

背景技术：

白桦(Betulaplatyphylla Suk.)是桦木科(Betulaceae)桦木属(Betula Linn) 的一种落叶乔木，主要分布在温带亚洲的日本、朝鲜、俄罗斯和中国等亚欧大 陆。早在《本草纲目》中记载，桦树皮可用于黄疸、乳痈、疥疮等疾病的治疗。 近年来的研究表明，白桦树皮的主要活性成分之一为三萜类物质，占树皮干重 的25％～30％左右。白桦三萜具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降脂、利胆和保肝等 作用(Kessler等，2007)，特别是白桦酯醇、白桦酯酸等三萜物质作为天然药物 在抗肿瘤和抗HIV等活性上显示出了与以往药物不同的作用机制，靶向作用性 更强，几乎无不良反应等特点(Jing等，2005；Wen等，2007)。因此，白桦 三萜作为药物化学中的先导化合物而逐步受到研究者的注视。

白桦三萜的获得大都从白桦树皮中提取和分离，这样不仅造成白桦资源的 破坏，而且作为新型药剂的临床研究，特别是推广应用的数量受到限制。而大 规模植物细胞培养技术因具有不受地区、季节、资源的影响，不破坏环境，通 过自动化控制细胞生长和合理调节代谢过程来降低成本和提高生产率等优点已 成为植物药品的新来源。

我们前期的研究发现，白桦愈伤组织可生产白桦三萜，其含量却显著低于 白桦树皮中(范桂枝等，2009；王博等，2008)，而白桦愈伤组织及其悬浮培养 的细胞具有增殖快、生长周期短、生长均一、繁殖培养简单等特点，是一种生 产白桦三萜的理想代替品。

真菌诱导子(fungal elicitor)是将分离培养的真菌的菌丝或培养液制备成诱 导子，它可以促使细胞快速、大量合成有用次生代谢产物。近年的研究表明， 利用来自真菌的诱导子成分，可以诱导植物悬浮细胞或植物幼苗产生或提高其 体内的次生代谢物。然而利用真菌诱导子提高白桦细胞中三萜含量的研究还未 见报道。

因此，我们期望通过真菌诱导子对白桦悬浮细胞的作用，提高白桦悬浮细 胞的产量和质量，使之成为白桦树皮的替代资源，来生产白桦三萜。该发明将 为利用细胞工程技术工业化生产白桦三萜奠定重要的理论和技术基础，也为新 型诱导子的开发和内生真菌与宿主间相互作用的机理研究提供依据。

发明内容：

本发明涉及筛选显著提高白桦三萜的内生真菌、内生真菌诱导子与白桦悬 浮细胞混合培养的方法，该方法工艺简单、周期短、成本低，为白桦三萜的工 业化生产创造条件。

本发明的目的在于提高白桦悬浮细胞中的三萜含量和产量。

为了达到这个目的，本发明利用白桦细胞的悬浮培养体系，筛选出了有效 提高白桦三萜的内生真菌—拟茎点霉属，并通过优化真菌诱导子的诱导技术使 白桦悬浮细胞中的三萜含量显著提高，确定了诱导子的添加浓度、适宜添加时 间和诱导时间，建立了真菌诱导子与白桦悬浮细胞混合培养生产白桦三萜的新 技术。

生物材料样品保藏：

拟茎点霉属BE55(Phomopsis sp.BE55)，保藏日期为2009年11月16 日，保藏单位名称及简称：中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉市武 昌珞珈山，邮编：430072，登记入册编号CCTCC No：M 209271。

技术方案：

(1)真菌的培养

将本实验室分离纯化的内生真菌从低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于 PDA培养基中，于25℃恒温培养10-15天，分别在菌落边缘打孔成菌片，取菌片 接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于25-28℃，100-180r/min摇床中培养7 天，收获菌体和培养液。

(2)真菌诱导子的制备

筛选有利于白桦三萜积累的内生真菌诱导子的制备方法：将纯化的内生真 菌菌丝发酵培养7天，将收获的菌液和菌体匀浆后121℃灭菌20min，以糖终浓 度60μg/ml制备成诱导子。

上述筛选出有利于白桦三萜积累菌种的诱导子的制备：

①真菌多糖诱导子：将收获的菌液和菌体匀浆后121℃灭菌20min，取其上 清液，上清液即为真菌多糖诱导子。上清液糖含量采用蒽酮比色法测定。