[发明专利]一种植物叶片特异性启动子及其应用

说明书

【技术领域】：本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一种新的植物 叶片特异性表达的启动子及其在转基因植物中的应用。

【背景技术】：启动子(promoter)是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基 因转录起始与否的DNA序列。一般来说，结构基因的组成可分为三个部分：启动子(promoter)、编 码区(coding region)及终止子(terminator)。编码区决定蛋白质的结构，终止子是决定mRNA长度的 区域，启动子则是一个基因转录起始的信息提供者，通常位于转录起始点的上游，也是调控基因 表达的关键区域。

真核生物基因的表达在四个水平上进行调控：(1)基因结构的活化；(2)转录水平的调控；(3)转 录后水平的调控；(4)翻译及翻译后的调控。对于大多数基因，转录水平是主要调控点。从效果来看， 是否转录是最经济、有效的基因表达调控方式。对特定基因转录机制的研究一直是基因表达调控 研究领域的热点。

基因表达与否，以及表达时间、表达部位需要启动子上的顺式作用元件与相应的转录因子的 协同作用。近20年人们在启动子研究方面展开了大量的工作，不仅克隆了数量丰富的启动子，而且对 其结构和功能有了一定的认识。从植物中已知的启动子分析，组织特异性及诱导型启动子的顺式 作用元件有一定的保守性，这些元件的种类、数量以及彼此之间的顺序与距离都可能影响基因的 转录与否或转录程度。如果能发现其中的规律，将会对基因表达的调控取得突破性进展。另外， 基因的特异性表达不仅包括在特定时期激活某些基因的表达，还涉及到在其他组织器官或发育时 期抑制某些基因的表达，对整体的研究将使人们更好地理解基因表达的调控过程。

获得性实验已经发现大量响应特异性表达模式的顺式作用元件，这些元件是与组成型的、发 育的、组织特异性的、激素的、环境调控相关的。例如：已发现的与Myb、AP2/EREBP、bZIP、 MADS、WRKY、ARFAux/IAA和Dof等这些转录因子相关的顺式作用元件。对于作为激活子、 抑止子、增强子和染色质修饰物的结合区域的特异性顺式作用元件本质的了解，是理解植物的结 合转录调控的关键(Venter和Botha，2004)。

深入研究和开发启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广 泛的应用价值。利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的 表达量，将生物能耗降到最低，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子 的营养或改善其品质。

根据植物中启动子的转录模式可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和 诱导型启动子。组成型启动子能在所有细胞、任何时候进行转录；组织或器官特异性启动子调控 下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中；诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很 低，但在诱导因子的作用下，转录活性能够显著地提高。

花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子是目前植物基因工程中使用最多的启动子，它具有多种顺 式作用元件驱使转基因产生组成型表达，应用非常广泛。但是由于组成型启动子驱动的基因在植 物各组织中均有不同程度表达，在植物基因工程的应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在 整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡， 有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使 用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla等， 1998)。因此，迫切需要寻找更为有效的代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。

组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，这类启动 子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的作用元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目 及相对位置等共同决定。随着植物分子学研究的不断发展，目前在拟南芥、水稻、番茄、咖啡、 百合等许多植物中已发现这类组织、器官特异性启动子，如Pyk10启动子(Nitz等，2001)在根中 特异表达、RBCS1启动子在叶中特异表达(Marraccini等，2003)、Bp4A启动子花粉特异表达(Albani 等，2000)、番茄E8启动子在(Sandhu等，2000)成熟果实中特异表达、LGC1启动子在雄配子细 胞中表达(Singh等，2003)。水稻谷蛋白GluB-1基因启动子在种子中特异表达(Takaiwa等，1986) 等等。