[发明专利]以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和构建方法及用途

说明书

【技术领域】：

本发明属于生物医药技术与恶性肿瘤的基因治疗技术领域，涉及重组腺病毒和真核表达质粒，具体为以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和真核表达质粒的构建及抑制人胶质瘤、乳腺癌和胃癌的生长，对上述肿瘤具有放疗增敏作用。

【背景技术】：

微RNA(microRNA或miRNA)为长度约21～25核苷酸的小型非编码RNA，能够识别特定的目标mRNA，并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用。miRNA-221/222是成簇的miRNA，与胶质母细胞瘤、前列腺癌、甲状腺乳头状癌等有关。

Ciafre`等小组应用微阵列的方法比较了9例原发性胶质母细胞瘤与核磁共振强化边缘2cm处“正常瘤周脑组织”的miRNA表达谱，发现超过半数的肿瘤组织过表达包括miR-221在内的9种miRNA。Gillies等研究发现，在脑胶质母细胞瘤中，miRNA-221、miRNA-222通过与p27^kip1mRNA的3^/-UTRs结合来降低p27^kip1的表达。这为脑胶质母细胞瘤提供了一种潜在的新的治疗途径。Galardi等发现miR-221与miR-222明显影响前列腺癌LNCaP细胞虫荧光素酶的表达。可以看出p27^kip1是miR-221、miR-222的靶基因。Pallante等在分析乳头状甲状腺癌的miRNA表达谱时发现，miRNA-222最高增高60倍，平均增高13.7倍。除了上述肿瘤，miRNA-221与miRNA-222在肝细胞癌、胰腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、直肠癌、肾癌和膀胱癌中均异常表。

【发明内容】：

本发明目的是应用遗传工程的方法在细胞内获得靶向敲低miRNA表达的构建方案，为此提出：

目的之一，提供可以用于产生siRNA的DNA序列组；

目的之二，提供含有目的一序列组的真核表达质粒及其构建方法；

目的之三，提供含有目的一序列组的腺病毒穿梭载体及其构建方法；

目的之四，提供目的三所述穿梭载体构建的腺病毒；以及，

目的之五，提供真核表达质粒和腺病毒的用途。

本发明应用遗传工程的方法在细胞内获得靶向敲低miRNA表达的构建方案，该方案可以获取重组腺病毒和真核表达质粒，并可应用于肿瘤治疗，运用该方法可以在实验条件下抑制人源性胶质瘤、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，同时上调抑癌基因PUMA、PTEN、Cx43和p27的表达，下调DNAPKcs和miR-21的表达；对肿瘤细胞具有增强效旁观者效应和放射治疗增敏的作用。

本发明的技术方案概述如下：

第一、本发明提供了四种用于产生siRNA的DNA序列

DNA序列1

5‘-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3’

DNA序列2

5’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3`

DNA序列3

5′-CACCGGATCCATTGTCTGCTGGGTTTCTTTTTTGAATAAAGAGCTC-3’

DNA序列4

5’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCACAGACAATGGATCC-3’。

第二、本发明提供了包含上述四组DNA序列的组合的真核表达质粒及其构建方法

具体如下：质粒为DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1。质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1的通用结构如图2示。质粒构建方法如下，将序列表中的DNA序列1/DNA序列2、DNA序列3/DNA序列4退火形成双链结构，通过亚克隆连接于质粒载体用以构建真核表达质粒，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组质粒。最终在Pgenesil-1中形成的酶切位点顺序为MluI—hU6promoter—KCNH11—HindIII—KCNH12—mU6promoter—BamHI—EcoRI—Sal。

第三、本发明在发明1的基础上构建了穿梭载体以及腺病毒