[发明专利]结核分枝杆菌噬菌体随机肽库

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，确切地说是结核分枝杆菌噬菌体随机肽库的构建。

背景技术

结核病是当今世界单一致病菌死亡率最高的疾病^[1]，占世界总死因的第七位^[2]。近年来由于耐药菌株的增加，多种药物联合作用的疗法已受到严重挑战，再加上治疗周期长和治疗费用的问题，迫切需要采取有效的预防措施来遏制结核病的增加。疫苗是控制结核病蔓延的有效方法。但是作为目前唯一获准用于预防结核病并普遍使用的疫苗卡介苗(BCG)，虽然自问世以来已使30亿儿童受益，但其作用不稳定，在不同人群中保护作用变化很大，且只对儿童起特异性作用。因此，卡介苗的局限性使预防结核病新型疫苗的研制成为控制结核病疫情的迫切之需。

确定病原的重要抗原表位是制造有效疫苗和建立准确特异的诊断方法的前提。抗原表位也就是位于抗原分子表面的抗原决定簇，它能够识别相应的抗体并与其进行反应。目前最有效最简捷的确定抗原表位的方法就是噬菌体肽库淘选技术。其原理是将抗体作为受体暴露于肽库中，淘选并分析所得到的能与抗体特异性结合的重组噬菌体肽的序列，就可以得到抗原决定簇的信息。因此，构建特异性噬菌体肽库并利用其淘选特异的抗原表位已成为近年来科研界的一大热点。目前对于噬菌体肽库技术应用于抗原表位的淘选，国内外报道已经很多，但是结核杆菌噬菌体随机肽库的构建及应用噬菌体肽库技术淘选结核杆菌抗原表位却未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌噬菌体随机肽库，是由下述方法制备的：

A、用现有技术方法提取结核分枝杆菌H37Rv基因组；

B、按H37Rv基因组12.0μl(DNA浓度4.8μg/μl)、DNase I0.5μl、10×Buffer1.5μl比例配制反应系，温度16℃消化结核分枝杆菌H37Rv基因组；反应30min；加入1/10体积的EDTA(0.25M)终止反应，得随机基因片段50-80bp；

C、取脱磷酸的噬菌体M13KE和平端化的随机DNA片段进行连接，连接体系为：M13KE8μl、随机DNA片段25μl、10×Buffer-24μl、T₄DNA连接酶(NEB)3μl，总体积为40μl；电击参数为：2mm电击杯，电压2500v，电阻200Ω，电容25μF；电击后记录数为：电压2385v，时间3.4ms，分别于16℃连接16h；得结核分枝杆菌噬菌体随机肽库，用TU(transducting unit，TU)值来衡量，库容量为62×100×100＝6.2×10⁵/ml；

所述的结核分枝杆菌噬菌体随机肽库用常规M13方法对噬菌体的扩增，然后进行三轮淘选：

第一轮淘选

1)96孔酶标板，鹿结核阳性血清IgG溶液(100μg/ml)作为靶分子溶液；

2)包被：每孔加150μl①溶液，沿孔壁加入使表面完全润湿；

3)在增湿容器中(装有湿纱布的可封口塑料盒)4℃过夜；

4)封阻：倒掉包被液，用力拍甩以除去残余溶液；每孔加满封阻液，4℃作用1h；

5)倒掉封阻液，用TBST(Tris盐缓冲液+0.1％[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次；倾去缓冲液，倒置在干净滤纸上拍甩以除去残余溶液。此操作要快以避免板干燥。

6)取100μl用TBST缓冲液稀释的噬菌体展示基因组肽库(滴度为1.50×10¹¹)，加入到已封阻的酶标板上，温和摇动10～60min；

7)倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净滤纸上拍甩除去残余溶液；

8)按⑤中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净的滤纸以避免交叉污染；

9)用非特异性缓冲液(0.2M Glycine-HCl，1mg/ml BSA)分离已结合的分子(温和摇动＞10min)，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中，用15μlMTris-HCl中和；

10)常规M13方法测定洗脱物扩增前滴度；

11)将测定滴度后剩余的洗脱物扩增：将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(对数前期，OD₆₀₀≈0.6)，37℃、200rpm振荡培养4.5h；

12)将上述培养物转入一离心管中，4℃10,000rpm离心10min。上清转入另一离心管中，再离心；

13)将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀过夜；