[发明专利]结核分枝杆菌的快速筛查方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种医学检测方法，尤其是涉及一种代替常规镜检的结核分枝杆菌的快速筛查方法。

背景技术

作为一种古老的传染病，结核病的疫情在全球呈上升趋势。据WTO估计，目前全世界约有20亿人感染结核杆菌，每年有800万新发病例和300万人的死亡。在我国，根据2000年第四次全国结核病调查估算，全国约有5.5亿结核病例，将近全国人口的一半。我国目前结核病的形式严峻，尽快建立先进的诊断技术和治疗措施，是一个紧迫的任务，不仅关系到千万人身心健康，也是关系到国民生计和国家经济发展的重要问题。

当前各医院及医疗机构在结核病的临床检验中使用的方法为：抗酸染色(荧光染色)、胸透、PCR、酶联免疫和培养法等。抗酸染色是当前检验肺结核的标准方法，但该方法灵敏度偏低，往往因为人为因素造成漏检；胸透的特异性不强；PCR虽然灵敏度高特异性强，但其对操作人员及环境要求较高，一般的基层医疗机构难以开展；酶联免疫法是最近几年才发展起来的新方法，但目前还没有一个公认的好的标示物，造成各生产厂家的试剂盒存在这样或那样的缺点；培养法虽然是当前公认的检查结核分枝杆菌的金标准，但由于结核分枝杆菌生长缓慢，需一个月的时间，严重影响了患者的及时治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测方便且准确率高的结核分枝杆菌的快速筛查方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的结核分枝杆菌的快速筛查方法，包括下述步骤：

第一步：标本液化

取病人痰标本和液化处理试剂按1:2-4的比例混合，使标本完全液化；

第二步：标本的富集和纯化

取结核分枝杆菌的特异抗体包被在磁性微珠上，形成包被有鼠抗结核分枝杆菌特异性膜抗体的免疫磁珠，然后将其加入到第一步经过液化处理的病人标本中，充分搅动使其完全结合在免疫磁珠上；收集上述免疫磁珠，用冲洗液冲洗后，得到处理好的待测磁珠；

第三步：发泡实验

将第二步处理好的待测磁珠用磷酸盐缓冲液稀释混匀，平分为两部分备用：将其中一部分加入到发泡试剂中缓慢混合均匀，3分钟后观察，如果发泡试剂管壁周围没有小的均匀气泡则直接将标本判为结核阴性；如果发泡试剂管壁周围有小的均匀气泡产生，则将另一部分置于68度水浴中处理后，再将其加入到发泡试剂中缓慢混合均匀，3分钟后观察，如果发泡试剂管壁周围有小的均匀气泡则可将标本判为结核阴性；如果发泡试剂管壁周围没有小的均匀气泡则可将标本判为结核阳性。

所述的液化处理试剂为重量比为1-5％的碱(NaOH)和0.5-5％N-乙酰-L-半胱氨酸的混合液。

所述的冲洗液为pH值7.4磷酸盐缓冲液和0.5-1％吐温-20的混合液。

所述的发泡试剂为1-5％过氧化氢和0.5-5％吐温-80的混合液。

本发明的优点在于采用纳米免疫磁性微珠分离纯化标本中的结核分枝杆菌，用冲洗液冲洗磁珠去除杂菌，用快速发泡试剂对经过磁珠处理的标本进行发泡检测，整个检测过程简单、易掌握，结果准确，可以明显提高结核病痰检的阳性率，将临床检验人员从繁重的镜鉴工作中解放出来，保证了结核病人的及时治疗。

具体实施方式

本发明所述的结核分枝杆菌的快速筛查方法，包括下述步骤：

第一步：标本液化

取病人痰标本和重量比为2％ NaOH和0.5％ N-乙酰-L-半胱氨酸的混合液(液化处理试剂)按1:3的比例混合处理10分钟左右，使标本完全液化；

第二步：标本的富集和纯化

取结核分枝杆菌的特异抗体抗LAM、抗mpt64或抗TBGL等多克隆抗体包被在磁性微珠上，形成包被有鼠抗结核分枝杆菌特异性膜抗体的纳米免疫磁珠，然后将10-100ug的纳米免疫磁珠加入到第一步经过完全液化处理的病人标本中，充分搅动使其完全结合在纳米免疫磁珠上；收集上述纳米免疫磁珠，用pH值7.4磷酸盐缓冲液和0.5％吐温-20混合液(磁珠冲洗液)冲洗三遍后，得到处理好的吸附有结核分枝杆菌的磁珠；

第三步：发泡实验

将第二步处理好的待测磁珠加入磷酸盐缓冲液1ml稀释混匀，平分为两部分备用：从其中一部分中取100微升加入到2％氢氧化氢和0.5％吐温-80混合液3ml中缓慢混合均匀，3分钟后观察，如果发泡试剂管壁周围没有小的均匀气泡则直接将标本判为结核阴性，即痰标本中不含结核分枝杆菌；如果发泡试剂管壁周围有小的均匀气泡产生，则将另一部分置于68度水浴中处理20分钟，从中取出100微升加入到3ml上述快速发泡试剂中缓慢混合均匀，3分钟后观察，如果发泡试剂管壁周围有小的均匀气泡则可将标本判为结核阴性，即痰标本中不含结核分枝杆菌；如果发泡试剂管壁周围没有小的均匀气泡则可将标本判为结核阳性，即痰标本中含有结核分枝杆菌。