[发明专利]一种结核分枝杆菌基因表达文库的构建方法及应用

权利要求书

1.一种用于构建结核分枝杆菌基因表达文库的组氨酸标签融合表达载体pETEXba，其特征在 于，它是通过如下步骤获得的：

1)将商购的载体pET28a上的XbaI酶切位点消除，获得一个中间载体pET28a-ΔX；

2)将步骤1)获得的中间载体pET28a-ΔX用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化；

3)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的cdc62基因作为第一个媒介基因，通过PCR的方法从极 端嗜热古菌S.solfataricus基因组中扩增获得末端含有NdeI和XhoI酶切位点的cdc62媒介 基因；

4)将步骤3)获得的媒介基因cdc62用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化；

5)将步骤2)的处理后获得的载体和步骤4)处理后获得的媒介基因在16℃连接过夜，得到第 二个中间载体pET28a-62；

6)将步骤5)获得的第二个中间载体pET28a-62用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；

7)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为第二个媒介基因，通过 PCR方法获得末端含有EcoRI和XhoI酶切位点的MCM媒介基因；

8)将步骤7)获得的MCM媒介基因用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；

9)将步骤6)处理后获得的载体和步骤8)处理后获得的媒介基因在16℃连接过夜，得到表达 载体pETEXba，其大小为6526bp，该载体pETEXba的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1 所示；

其中：

步骤3)中cdc62基因的扩增所用的引物对的序列如下：

正向引物14bEcoR-f：GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，

反向引物14bEcoR-r：ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT；

步骤7)中MCM基因扩增所用的引物对的序列如下：

正向引物TrgXcm-f：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，

反向引物Xcm-r：GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。

2.根据权利要求1所述的表达载体pETEXba，其特征在于，它还包括一个适用于克隆结核分 枝杆菌所用编码基因的多克隆位点。

3.一种构建结核分枝杆菌基因表达文库的方法，其特征在于如下步骤：

1)利用PCR反应获得结核分枝杆菌的全部编码基因；

2)将步骤1)所述的结核分枝杆菌的全部编码基因精确克隆到权利要求1所述的表达载体中， 转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，得到结核分枝杆菌基因表达文库。