[发明专利]一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法。

背景技术

多肽是化学学科研究的一项重要内容，在生化，医药，免疫和基因科学等学科和领域都起了巨大的推动作用。长期以来，几乎所有多肽合成的研究都是以氨基酸为原料通过化学合成方法来进行的。这种方法步骤麻烦、成本较高，使得多肽类材料的应用受到限制。

随着科技的发展，生产肽的方法也在不断发展。五六十年代，主要是从动物脏器获取肽。后来又发展到液相合成法。1963年，R.B.Merrifield创立了将多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次偶联氨基酸，延长肽链、合成多肽的固相合成法。多肽固相合成技术的发明促进了肽合成的自动化，但只能用于小规模的实验室合成，并且对有些序列的多肽，如多个疏水氨基酸，连续的大侧链基团的胺基酸，合成非常困难。

随着蛋白表达技术的成熟，多肽也应用到这种技术。然而，直接在大肠杆菌中表达多肽都不能成功，主要是由于多肽是线性不折叠的小分子，在大肠杆菌中容易被降解。由于多肽分子量较小，难以通过常规的电泳技术来检测。为了解决这个问题，人们尝试着将多肽融合到一个载体蛋白的C端。这种融合多肽可以在大肠杆菌中表达、纯化，利用蛋白酶将多肽切下。但这种方法主要存在以下缺点：融合蛋白比较大，导致多肽的表达量比较低；切割时，会发生非特异性切割，由此而产生一些杂肽，增加纯化的难度；所使用的酶，价格比较贵；无法对沉淀的包涵体蛋白进行切割。由于以上缺点也造成这种技术不能得到广泛利用。为克服这些缺点，我们发明了一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的新方法。本方法产量高、成本低、易于纯化，重组多肽即使以包涵体的形式表达，也可以进行切割。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，以克服现有技术的不足，按本发明方法制备的多肽产量高，成本低，环境污染少，且易实现大规模生产。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，该方法以葡萄球菌核酸酶为载体蛋白，将目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之间有一个半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大肠杆菌中表达，并纯化；然后多肽通过化学裂解技术从葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割下来；该方法具体包括如下步骤：

(1)基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease -Peptide)的碱基序列，经过双酶切该碱基序列和表达载体序列，纯化双酶切的两个序列，将碱基序列与表达载体序列进行连接，这就是构建的表达载体；通过酶切、测序鉴定构建的表达载体是否准确；

(2)转化表达载体到表达宿主细胞，并进行诱导表达重组多肽；

(3)收集、破碎细菌，纯化表达的重组多肽；

(4)以乙醇为溶剂，沉淀并收集纯化的重组多肽；

(5)将沉淀的重组多肽重溶于盐酸胍缓冲液，加入DTT和NTCB；

(6)溶液pH调至9.0-9.5进行切割；

(7)将切割混合物过柱进行纯化。

本方法的关键创新是如下3点：

(1)引入葡萄球菌核酸酶基因作为重组蛋白-多肽的载体。葡萄球菌

核酸酶的表达产率非常高，纯化非常简单。只需过一次SP-Sepharose(SP琼脂糖凝胶)层析柱，就可达到95％以上的纯度。

(2)利用半胱氨酸的氰基化反应，重组蛋白-多肽的切割采用特异性化学裂解法，这种切割法具有较高的特异性.它只能特异的切割x-Cys之间的化学键，x可以为任何残基，切割产物为葡萄球菌核酸酶、少量未被切割的葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白及目的多肽。多肽可以通过过一次SP琼脂糖凝胶层析柱得到纯化。

(3)这种切割要在尿素或盐酸胍条件下进行，因此即使载体蛋白-多肽的融合蛋白以包涵体形式表达，切割也不受影响。

本发明的以上特点解决了其它方法所存在的主要问题，这是一种高产量、低成本的生产多肽方法。

在本发明中，重组表达载体可以用本领域熟知的方法引入宿主细胞，这些方法包括：电转化法，氯化钙法，基因枪法等。将外源重组载体导入宿主细胞的过程称为“转化”。通过培养宿主细胞，诱导所需蛋白的表达，并通过本领域所熟知的蛋白分离技术，如柱层析等得到所需的蛋白质。