[发明专利]一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法

权利要求书

1.一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，其特征在于，该方法以葡萄球菌核酸酶为载体蛋白，将目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之间有一个半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大肠杆菌中表达，并纯化；然后多肽通过化学裂解技术从葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割下来；该方法具体包括如下步骤：

(1)基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽的碱基序列，经过双酶切该碱基序列和表达载体序列，纯化双酶切的两个序列，将碱基序列与表达载体序列进行连接，这就是构建的表达载体；通过酶切、测序鉴定构建的表达载体是否准确；

(2)转化表达载体到表达宿主细胞，并进行诱导表达重组多肽；

(3)收集、破碎细菌，纯化表达的重组多肽；

(4)以乙醇为溶剂，沉淀并收集纯化的重组多肽；

(5)将沉淀的重组多肽重溶于盐酸胍缓冲液，加入DTT和NTCB；

(6)溶液pH调至9.0-9.5进行切割；

(7)将切割混合物过柱进行纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：以葡萄球菌核酸酶为融合多肽片段的载体，采用限制性内切酶位点Nde I和Xho I进行双酶切合成的碱基序列、pET21a表达载体序列，通过连接试剂盒连接两个酶切的序列，这就是构建的表达载体；通过酶切、测序鉴定构建的表达载体是否准确。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)通过热激法转化表达载体到表达宿主菌BL21(DE3)37℃培养表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a至OD700nm为1.0，加入终浓度为0.4mM IPTG，37℃诱导表达4小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)通过超声波破碎细菌，过SP琼脂糖凝胶纯化表达的葡萄球菌核酸酶重组多肽。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中用乙醇来沉淀纯化的重组多肽，乙醇与重组多肽溶液混合的体积比为3∶1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中将乙醇沉淀的重组多肽重悬于6M盐酸胍，50mM tris，pH 8.0的溶液中，室温，搅拌重溶1小时，13000rpm/min离心20分钟；取上清，计算重组多肽溶液中巯基浓度，加入3倍于巯基浓度的DTT量，37℃搅拌放置1小时；再加入10倍于此时重组多肽溶液中巯基浓度的NTCB量，37℃搅拌20分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中将溶液pH值调至9.0-9.5，37℃搅拌切割16-20小时。