[发明专利]3-甾酮-9α-羟基化酶基因、3-甾酮-9α羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶技术领域，特别是指一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因、一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用。 

背景技术

甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核，结构相似的化合物。其基本结构如下所示，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A、B、C、D环，在母核的第10、13位有甲基，第3、11、17位可能有羟基、酮基或烷基，A、B、C与D环可有双键，17位上常有长短不同的侧链。由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。 

9α-羟基甾体化合物是制备9-卤代肾上腺皮质激素与11-酮基甾体的重要前体物，具有9α-羟基化功能的微生物多是甾体化合物的降解菌，例如红球菌、分枝杆菌、简单节杆菌、链霉菌、诺卡氏菌等，这些菌不能直接应用于生产。国外已通过菌种选育、反应体系优化等工作，使分枝杆菌与红球菌在对甾体侧链解的同时实现甾体的-9α-羟基化，但由于生产效率不高、有甾体1-位脱氢等副反应存在，因而近几年有学者通过对红球菌甾体1-位脱氢酶的敲除研究，获得了无甾体1-位脱氢副反应的基因工程菌。因此，如果能够克隆鉴定9α-羟基化酶基因，从而构建相关高效表达载体，进而实现9α-羟基化酶的高效表达，这必将大大提高相关甾体药物的生产效率，并减少副反应发生。 

当今甾体药物生产采用的是微生物转化与化学转化相结合的方法，其中一些微生物转化反应在转化效率、反应选择性、环境友好性等方面具有化学转化法不可比拟的优势，因此在甾体药物的生产中占有重要地位，得到了大规模应用。 

作为甾体药物工业生产体系中的瓶颈环节，一些微生物转化反应严重制约着甾体医 药产业的快速发展，同时也是甾体药物生产成本高昂的一个重要原因。我国甾体医药生产企业众多，产值巨大，针对当前一些重要的甾体微生物转化反应，成功进行高效生产菌株的改造与开发，必将受到产业界的欢迎，从而从整体上大大提升我国甾体医药产业的生产水平，其产生的经济效益将是十分可观的。 

针对甾体医药工业生产体系中的重要微生物转化反应，通过基因工程技术改造，开发高效微生物转化反应，可大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，从而有助于甾体药物价格的下降。此外，微生物转化反应条件温和、环境友好，属绿色化工技术，大力推广其在生产中的应用，是社会可持续性发展的必然要求。 

发明内容

本发明的主要目的就是针对上述存在的问题与不足，提供一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因、一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用，采用这些工程菌可以进行3-甾酮-9α-羟基化，可以大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用。 

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特点是，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。根据本发明的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，可实现多种基因工程菌株的构建，包括无3-甾酮-9α-羟基化酶活性或高3-甾酮-9α-羟基化酶活性的菌株。 

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第1328-2516位核苷酸序列具有70％以上的一致性，更优的是具有87％以上的一致性或与所述SEQ ID NO：1所示序列具有60％以上的一致性。SEQ ID NO：1所示序列的其余核苷酸序列含有该酶的调控元件与邻近基因片段。 

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性，更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有90％以上的一致性。 

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因来源于分枝杆菌属微生物。 

更佳地，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。