[发明专利]一种三维转移性肝癌类组织体外模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种三维转移性肝癌类组织体外模型的构建方法，属于组织体外模型的构建方法技术领域。

背景技术

传统的单层平面培养技术在癌症体外细胞模型建立、癌细胞生物学行为分析中一直发挥着主导作用，但受细胞培养方法本身及癌细胞数次传代的限制，细胞的形态、极性、基因表达乃至功能状态与体内癌细胞的实际病理生理状况相距甚远，由此产生的两维体外癌细胞模型在疾病分子病理机制的探讨中受到越来越多的挑战。近些年，体外三维培养技术进展及癌细胞生物学特性的深入研究，使得模拟体内组织细胞生长环境具有明显优势的立体培养，在癌细胞生物学特性解析、药物疗效的评估中受到普遍的关注。

单层平面培养时细胞由于受重力作用而自然沉降在支架材料上，使细胞贴壁而无极性，细胞的形态由球形转为扁平状，由此影响细胞的分泌功能及部分关键基因的异常表达，且单层平板培养无法反映细胞与细胞之间，细胞与基质微环境之间等多维的相互作用，从而缺少有利的实验证据对细胞间粘附、信号转导等生物学过程进行体外模拟研究，单层平板培养的细胞生物学特征与体内细胞真实的生理病理状况也相去甚远。三维立体培养技术克服了上述单层平板培养的不足，较好地模拟再现细胞在组织体内接近真实的生存状况，对体外细胞生物学功能的深入解析产生有力的推动，在细胞功能研究上，体外三维立体培养技术具有明显的优势，主要包括(1)简化宿主体内复杂生长环境，提供易于重复研究的特定体外模拟培养环境，有利于三维状态下细胞的分化，生长等生理病理特征解析。(2)在特定培养体系中，提高了同种细胞、异种细胞间的相互作用，结构上易于建立起紧密的缝隙连接，桥粒连接。(3)增强胞外基质的产量，易于观察胞外基质对细胞生长、分化、迁移等细胞生物特征的影响。(4)体现出分化细胞的基因表达状况和相关功能特征。

RWV生物反应器的出现在三维培养的方法学进展上具有突破性的意义，该装置是美国国家航空航天局科学家为评价微重力与液体低流速对细胞培养的潜在影响而发展起来的，它由一水平旋转并能通过底部硅树脂膜进行气体交换的壁式组织培养器皿和旋转控制器组成，通过对旋转速度的调节形成低剪切、微重力体外环境，增强培养细胞的组织样黏附与聚集，并对细胞的生长增殖，分化，细胞因子分泌及细胞间的相互作用产生影响。低剪切、微重力的体外培养环境使其明显优于静止及其它高剪切的旋转三维培养技术，成为目前细胞三维培养最常用的技术之一，另外在多种细胞间的混合培养方面，该体系也具有明显优势。材料科学的进步与发展为三维细胞培养方法的提高与改进也提供了更多选择，微载体珠，可降解生物支架是当前三维立体培养中应用较广的两种起机械支撑材料，前者的优势在于能较大面积地促进细胞间的粘附聚集，尤其在不易发生自发聚集的细胞系，常规条件下难培养的细胞及敏感性高的细胞生物学功能的研究上有独特的优势，但微载体珠应用需联合旋转瓶或旋转摇床培养而带来的整合优化问题，以及形成假球形体中含有大的微载体珠是该法期待解决的难题。可降解生物支架引入三维培养主要利用其模拟胞外基质成分的性质和提供细胞培养中三维机械结构的支撑，常用生物材料包括胶原组分和合成聚合物(聚羟基乙酸或聚乙醇酸PGA，聚乙醇酸-乳酸共聚物PLGA)，这类生物材料应用于三维培养中可有效地提高体外细胞的长期生长、分化，而且其基质成分的性质也参与增强信号传导过程而对关键细胞功能迁移、增殖、分化等产生影响，生物支架材料在三维培养中的应用是目前体外再生活组织天然结构和功能形成最理想的一种方法。

理想的体外肿瘤模型既能较好地模拟体内肿瘤的生存环境，也应有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的实验解析。在肝癌体外转移模型建立方面，复旦大学肝癌研究所进行了大量创造性的工作，先后建立了人肝癌裸小鼠移植模型(LTNM₁-LTNM₄)、人肝癌裸大鼠移植模型(LTNR₁、LTNR₂)，高转移人肝癌裸小鼠模型(LCI-D20)、转移潜能不同人肝癌细胞系(MHCC97L，MHCC97H，LM3，LM6)，上述转移模型被国内外学者大量研究应用，对肝癌转移复发分子机制的阐明起到积极的推动。但受技术和方法的限制，在体外肝癌肿瘤组织模型建立方面依然空白，而且从肿瘤细胞生物特性来看，体外多次传代的二维贴壁培养肿瘤细胞易改变或丢失肿瘤细胞的某些表型特征、生物特性，且常出现基因水平表达模式、药物筛查情况与临床标本不一致的情况。

发明内容