[发明专利]一种检测庆大霉素的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

说明书

技术领域  本发明属生物医药技术领域，为食品安全，药物检测试剂。具体而言，本发明利用免疫反应的高灵敏性和特异性，以及酶促反应的放大效应和易检测性，建立起来的一种检测庆大霉素的酶联免疫测定试剂盒。

背景技术  庆大霉素(Gentamicin)属氨基糖甙类抗生素，被广范应用于医学临床和兽医，以治疗人及动物的多种感染性疾病。但该药对神经系统和肾脏具有毒性作用，有引起听力障碍和肾功能损坏的潜在危险。因此，在食品中的残留会影响人类健康，欧美国家及我国均要求其限量使用。在动物性食品中，欧盟的限量标准为不得超过50ng/g。在医学临床治疗时，庆大霉素在血中的有效浓度为5～10μg/ml，潜在中毒浓度为＞12μg/ml，由于人类对药物治疗的反应性不同，中毒剂量也不同。每个病人都需要自己的用药方案，这就是临床医学的个性化治疗。因此，对诸如庆大霉素一类有毒性剂量信赖性的药物，在用药过程中，必须进行血药浓度的监测。本试剂盒为食品中庆大霉素残留检测和临床庆大霉素血药浓度监测，提供了一种高效，快速，特异的检测方法。

氨基糖苷类抗菌素常用的检测方法有：薄层色谱、离子交换色谱、气相色谱、液相色谱、质谱或气-质、液-质联用技术等。

薄层色谱灵敏度低，仅能检测出微克(μg)级以上的样品。不能满足食品中残留庆大霉素的检测要求。离子交换色谱受诸多因素(如PH，温度，离子强度等)影响，难以实际运用。

气相色谱法(GC)：由于氨基糖苷类抗菌素中含有多个极性基团、不挥发、因此不适宜直接进行GC分析。必须对氨基糖苷类抗菌素结构中基团进行衍生化处理后，才能测定，故步骤繁多。

液相色谱法(LC)：液相色谱对氨基糖苷类抗菌素的检测，包括反相色谱和正相色谱，用来检测血浆中的氨基糖苷类抗菌素。虽然该方法的灵敏度可以基本达到兽药残留检测要求，但不能进行定性确认。

液相色谱-质谱联用法(LC-MS)：液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，其检测灵敏度高，能对各氨基糖苷类抗菌素微量残留进行检测，是目前检测食品中氨基糖苷类抗菌素残留确证检测的最佳方法之一。

以上仪器分析法其设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高。本发明利用酶联免疫测定原理，定量检测血清，动物组织，，胆汁，尿液中的庆大霉素残留，不需要昂贵的仪器投入，一般中等文化水平的人员，经过短期培训，就可掌握其检测方法。该试剂盒检测多种样品中的庆大霉素，可满足食品中庆大霉素残留的快速监测，也为临床医学中，庆大霉素血药浓度监测，提供了一种高效，快速，特异的检测方法

发明内容 本发明提供一种快速检测庆大霉素的酶联免疫试剂盒。其生产的庆大霉素试剂盒，线性范围为1ng/ml～80ng/ml，IC₅₀为20ng/ml左右，灵敏度为0.5ng/ml。稳定期在6个月以上(4℃冰箱保存)。

本发明公开免疫原的合成，动物的免疫，特异性抗体的制备，酶标抗原的制备，试剂盒的调试和装配，试剂盒各种参数的确定及样品的前处理和测定。

庆大霉素，是由小单孢菌产生的抗生素。包括庆大霉素C_1。C_1a，C₂，分子量为449-477，属小分子物质，不具有免疫原性而仅具有免疫反应性，要制备庆大霉素酶联免疫测定试剂盒，必须要制备对庆大霉素有高度特异性的抗体。要获得对庆大霉素有高度特异性的抗体，首要条件是要有一个能激发动物产生抗体的免疫原。其解决方案是庆大霉素共价连接上一个大分子物质，通常是与一种蛋白质交联。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白等，本发明公开一种制备庆大霉素免疫原的方法。主要是用2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲溶液为溶剂，用水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺(EDAC)；或1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺对甲基苯亚磺酸盐(CMEC)，为交联剂，首先活化载体蛋白分子中游离羧基，再与庆大霉素分子中的游离氨基相连，生成免疫原。

有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫动物，本发明是免疫1.5～2kg大小的新西兰雌性家兔，获得对庆大霉素有特异性反应的多克隆抗体。本发明提供一种能产生高滴度抗体的免疫方案。