[发明专利]用于快速筛选和鉴定有效shRNA的载体及其筛选和鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速筛选和鉴定有效shRNA的方法，包括用于筛选和鉴定有效shRNA的真核表达载体的构建及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene silencing)。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解，从而抑制了该基因的表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。科学界普遍认为，通过利用RNAi，操纵细胞的核糖核酸(遗传信使)，干扰或压制目标基因，以防止那些会导致疾病的蛋白质形成，有可能产生出前景不错的治疗药物，用于治疗包括癌症、失明和艾滋病在内的疾病。

目前，人们已经成功地使用发夹状RNA或以质粒DNA或病毒为载体在细胞内生成小干扰RNA样转录物，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳类动物或人细胞内的表达。用质粒DNA或病毒为载体可在细胞内长时间、稳定地生成小干扰RNA。此类研究将有助于把RNA干扰技术用于治疗人类疾病。

RNA干扰研究及应用的一个前提是筛选到有效的shRNA，然后将此有效shRNA构建至真核表达载体或病毒表达载体，进行后续研究和应用。

针对某一个靶基因，根据shRNA靶序列设计原则，一般来说会有多个候选的shRNA序列。这些利用各种设计软件设计出的shRNA序列，其仅仅在理论上可能对靶基因有干扰效果，但是其实际的干扰有效性还需要进行实践筛选和验证。

目前筛选和验证有效shRNA，往往需要利用RT-PCR或Western-blot的方法，费时、费力，特别是待选shRNA数量较多时，会大大增加工作量和实验成本。

发明内容

为克服上述筛选和验证有效shRNA时的缺陷，实现快速、简便地筛选和验证有效shRNA，本发明提供了一种技术方案为：用于快速筛选和鉴定有效shRNA的真核表达载体，将如下结构构建至同一个真核表达载体上：：1)由polIII型启动子调控的shRNA表达框结构，即polIII型启动子+shRNA插入位点，用于插入待筛选和鉴定的shRNA；2)由CMV启动子调控的荧光蛋白表达框，在荧光蛋白基因后面紧跟一个多克隆位点(MCS)，用于在其中插入与待筛选和鉴定shRNA相对应的靶序列片段。3)由SV40启动子调控的荧光蛋白表达框，该荧光蛋白的荧光颜色与第2)中的荧光蛋白的荧光颜色不同。

所说的由CMV启动子调控的荧光蛋白可为绿色荧光蛋白(EGFP)。

上述载体结构中还可以包括由SV40启动子调控的荧光蛋白表达框。所说的红色荧光蛋白可以为(RFP)。

所述polIII型启动子为hU6、mU6、hH1或h7SK启动子；所述载体还包括Kan或者Amp抗性筛选标记。

根据上述技术方案，本发明还提供了一个真核表达载体，序列如SEQ NO 1所示。

另外，本发明还提供了一种快速筛选和鉴定有效shRNA的技术方案，其特征在于，该方法为：将待筛选和鉴定shRNA和与其对应的靶序列片段插入上述的真核表达载体，其中，shRNA靶序列片段插入到荧光蛋白基因后的多克隆位点，再将得到的载体转染至细胞中，与转染了未插入shRNA片段的空白载体的细胞相比，荧光明显减弱，则待筛选shRNA为有效shRNA。

所述细胞为易转染、易培养的细胞，优选293细胞。

其中shRNA的结构包括sense、loop、antisense和5T或6T终止信号。

待筛选和鉴定shRNA相对应的靶序列片段，可以以该条shRNA所针对的欲干扰基因上的靶位点序列为中心，然后各向两侧延伸15～25个碱基，以这样一条片段(总长度大约为49～69bp)作为与待筛选和鉴定shRNA相对应的靶序列片段。简单举例说明：如果shRNA针对的是CCCC，那么它的结构差不多是CCCC-loop-GGGG-5T或6T终止信号，那么相对应的靶序列片段就是CCCC。即，所谓的靶序列片段，就是某个shRNA针对的那一段序列，也就是整个shRNA结构中的sense序列。本领域普通技术人员能够知道”靶序列片段”如何确定。