[发明专利]一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建及其应用

权利要求书

1.一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体，是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体，所述的pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体是在pGCSIL-GFP载体的MCS中连接了针对ShRNA的双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列如下：

PSCSI625：

5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’。

2.权利要求1所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，根据PKCγmRNA序列，设计合成了针对ShRNA的双链DNA片段，所述的双链DNA片段的序列如下：

PSCSI625：

正义链：5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

反义链：3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’

然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的MCS中构建成pGCSIL-GFP/U6-ShPKCγ重组载体；再将pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体、具有图2所示结构的pHelper1.0、图3所示结构的pHelper 2.0三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。

3.根据权利要求2所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，在所述的DNA片段末端引入AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

4.根据权利要求2所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，用AgeI和EcoRI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段，将所述的大片段与DNA片段用T4 DNA连接酶连接后转化感受态菌DH5α，挑取重组阳性克隆。

5.权利要求1所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的应用，其特征在于，所述的重组慢病毒载体用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的制剂。