[发明专利]克服预存免疫反应对腺病毒载体产品不利影响的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种克服预存免疫反应对腺病毒载体产品不利影响的方法及其应用。

背景技术

腺病毒(Adenoviruses，Ad)是一种特征性的二十面体病毒壳体，它的基因组是线性的双链DNA，约34kb到43kb。Ad的宿主范围很广。人源Ad可分为6个亚群，约51种血清型。目前开发的腺病毒载体主要以5型腺病毒(Ad5)为主，Ad5载体系统作为基因转移载体有如下诸多优点：

1)安全性：对腺病毒(尤其是Ad5和Ad2)基因组和各基因功能及致病情况的研究较其他病毒载体最为透彻；腺病毒不整合到染色体中，无插入致突变性，不会干扰其它的宿主基因。5型腺病毒比较温和，正常人感染后可以自愈；通过删除、置换E1区，可造成腺病毒的复制缺陷，并且避免了E1基因对细胞的转化作用，因此更加安全。

2)有效性：腺病毒可以高效的感染处于分裂期与静息期的细胞，而且携带的外源基因可以长时间高水平地表达；重组腺病毒载体具有很高的容纳外源基因的能力，经过改造的腺病毒载体可允许插入长达40kb的基因，并且能同时表达多个基因。

3)生产工艺成熟：腺病毒可以在宿主细胞中复制增长到很高的滴度(达到1×10¹¹pfu/ml)，适于重组疫苗的大规模生产；腺病毒的物理化学性状比较稳定，可以冷冻保存数月不失去感染能力，所以可以方便地运输、储存重组腺病毒疫苗成品。

由于重组腺病毒具有以上优点，因而Ad载体作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体备受青睐。目前全球范围内以腺病毒作为载体治疗传染性疾病、癌症、心血管疾病、单基因疾病等的临床实验有342例之多，在各类载体中占首位(24.8％)。我国具有自主知识产权的世界上第一个基因治疗药物今又生(重组人p53腺病毒注射液)，使用的也是复制缺陷型的Ad5载体。

然而由于自然感染腺病毒，大多数人体内长期维持着一定水平的抗腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞(CTL)。研究表明非洲和美洲地区的人群中Ad5型中和抗体阳性率很高，部分国家阳性率甚至超过90％。我们实验室的初步数据也表明中国广东人群中Ad5型中和抗体阳性率也高达75％。有确信的证据表明这些中和抗体会对基于腺病毒载体产品产生中和作用，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之预存的免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效率。为了克服预存免疫反应对腺病毒载体产品的影响，提升腺病毒载体的应用范围，研究者们尝试了多种方法：

1)通过对机体的免疫抑制或免疫调节来限制预存免疫反应对腺病毒载体的影响。使用的免疫抑制剂包括环孢霉素、环磷酰胺、FK506等。这些研究的缺陷在于这种方式的免疫抑制或者免疫调节特异性较差，容易产生副作用，不适用于机体免疫力较差的群体。

2)使用聚乙二醇共价修饰病毒壳蛋白或者通过阳离子脂质体对病毒颗粒进行包裹以掩盖腺病毒表面的中和抗体结合位点。研究证实这种方法在小鼠和猴子中能有效降低机体对腺病毒本身的免疫反应，因而可以实现一定程度的重复利用腺病毒载体。但这种包裹使得病毒颗粒进入细胞后不能有效释放，转基因的表达也大为降低。

3)使用嵌合型腺病毒载体以改变腺病毒与宿主细胞表面的相互作用，这方面的研究主要集中在对重组腺病毒纤毛(fiber)和纤毛头节区进行修饰。但这种嵌合型载体也只能一次性使用，因为使用一次后机体就会产生针对改造过的腺病毒载体的中和抗体。

4)使用非人类腺病毒作为载体或使用人群流行率较低的稀有血清型腺病毒作为载体。非人类腺病毒载体主要为猿腺病毒载体，人的稀有血清型腺病毒包括Ad26，Ad35，Ad41等等。这些载体近几年发展比较迅速，但这种载体的最大问题在于它们的安全性还未得到证实，而且这种方法也不能从根本上克服再次使用这些载体时机体已经产生的免疫反应。

因此开发一种更加安全，有效，且使用方便的克服预存免疫反应对腺病毒载体产品不利影响的技术无疑有着重要的临床应用价值。

发明内容

为了能更加安全，有效，且使用方便的克服预存免疫反应对腺病毒载体产品不利影响，本发明提供了一种克服预存免疫反应对腺病毒载体产品不利影响的方法(AVIP)及其应用。

本发明的具体技术方案如下：