[发明专利]化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

说明书

技术领域

本发明化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及的是化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gD糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是最早发现的人类疱疹病毒，容易导致复发性感染和潜伏感染，对人体危害严重，分为HSV-1及HSV-2两个血清型。1型单纯疱疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近年HSV2的感染显著增多，约占该病的10％～40％。目前药物治疗HSV感染时常出现相应耐药性，所以研制疫苗是切实可行的有效方法，它能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。至今已研制了多种HSV疫苗，已有两种HSV糖蛋白疫苗进入III期临床试验，即Chiron公司研制的重组gD2/gB2糖蛋白与MF59佐剂配伍而成的疫苗以及Glaxo Smith Kline(GSK)公司开发的重组gD2糖蛋白与另一佐剂(3-de-O-酰化单磷酸类脂A和明矾)配伍而成的疫苗，这两种疫苗均有一定的保护作用，但临床效果有限。国内目前对HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。

目前认为HSV基因组有34个基因，编码70多种蛋白质，其中胞膜糖蛋白正式命名的有12种，它们以独特或复合体的形式在HSV复制循环及病毒的感染致病中发挥不同的作用。其中gD由HSV的US6基因编码，是病毒胞膜的主要成分，对于病毒与细胞稳定结合具有重要意义，促进病毒胞膜和细胞间的溶解，介导病毒的胞间扩散、释放。同时gD蛋白在病毒的复制和刺激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶标之一，因此HSV2gD糖蛋白是构建HSV基因疫苗理想的目的基因。

HSV2病毒gD糖蛋白基因全长1185bp，编码312个氨基酸序列的胞外区、54个氨基酸序列的跨膜区、28氨基酸序列的胞内区。研究表明，为增强编码抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性编码序列，特别在完整抗原蛋白对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原蛋白进行截短表达就尤其重要。而截短后的gD基因构建的疫苗，与用完整gD基因构建的疫苗对HSV2病毒攻击具有相同的保护作用。

发明内容

本发明目的针对上述不足之处提供一种化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用，是化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸到第286个氨基酸，共286个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。

化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实施的：

1.HSV2病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV2病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，发现gD糖蛋白的N端(第1氨基酸到第286氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了Hind III酶切位点(下画线部分)，转录调控序列(GCCGCCACC)，起始密码子(ATG)，人IgG κ轻链信号肽(波浪线部分)，8×His标签及TEV蛋白酶酶切位点(gaaaacctgtacttccagggt)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和BamH I酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pCEP4内的Hind III和BamH I酶切位点内，并且使gD蛋白更易于表达和纯化。