[发明专利]一种生物发酵提纯他克莫司的方法

权利要求书

1.一种生物发酵提纯他克莫司的方法，其特征在于利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品；具体步骤如下：

1)用发酵过滤后的菌丝体5～10倍体积的有机溶剂抽提2～3次链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；其中有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲醇；

2)用发酵上清液1～2倍体积的疏水性溶剂萃取链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618发酵上清液，控制溶液温度为15～35℃和pH值为6-12，得疏水性萃取液；

3)合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经超滤膜过滤后，进入装有大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1∶5～1∶20，用1～4倍大孔树脂体积的有机溶剂进行冲洗，并用1/3～1倍大孔树脂体积的有机溶剂进行解吸，控制溶液温度为15～35℃和pH值为6-12，得解吸液；其中冲洗的有机溶剂为体积浓度45～55％丙酮或甲醇；解吸的有机溶剂为体积浓度70～80％丙酮或甲醇；

4)真空浓缩解吸液，并用1～4倍解吸液体积的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水，再次真空浓缩；将真空浓缩后的浓缩液经与浓缩液体积比为1∶10～1∶20的甲醇-水混合溶液溶解，其中甲醇和水混合溶液中甲醇和水的体积比为1∶1～1∶1.5；在反相硅胶柱中用和浓缩液体积比为1∶2～1∶7的硅胶进行层析分离，用2～3倍硅胶体积的洗脱剂进行洗脱，收集含他克莫司的活性组分；其中洗脱剂为体积浓度50～75％甲醇或乙醇；

5)真空浓缩含他克莫司的活性组分，并将活性组分溶于2～5倍体积的结晶溶剂中冷却结晶得到他克莫司。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中疏水性溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲苯。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤5)中结晶溶剂为乙腈、甲醇或乙醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中用乙酸乙酯或丙酮提取解吸液的次数为2-3次；步骤5)中结晶温度为5～25℃，结晶时间为15～60小时。