[发明专利]人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备

说明书

技术领域

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融合蛋白药物技术领域：涉及到重叠PCR等DNA重组技术，药物蛋白与HSA的融合使得药物成为长效药物。

背景技术

人甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的，人体内调节钙磷代谢的重要激素之一。它通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶和蛋白激酶C，改变骨吸收和骨合成的速率，影响骨代谢。研究表明，小剂量间歇性应用PTH，会刺激骨的形成，并且能通过诱导骨合成作用有效的治疗骨质疏松症。成熟的PTH有84个氨基酸残基，但早在70年代末Tregear等就证明了只需要氨基端1-34肽就能保留完整的钙磷调节作用，具有PTH完整的生物学活性。hPTH(1-34)被认为是hPTH在体内的自然分解产物，它保留了自然Hpth所有可测的生物活性，具有抗骨重吸收和促骨形成双重作用，能显著降低脊椎骨和非脊椎骨骨折风险，对预防和治疗妇女绝经后骨质疏松有良好的效果。

由于hPTH(1-34)分子量非常小，体内代谢速度相当快，肌肉注射半衰期为一小时，静脉注射半衰期只有五分钟，因此为了达到治疗效果，常常需要频繁大剂量用药。昂贵的价格和频频用药造成的不便严重限制了此种药物的应用。

基因串联体技术是将数个目的基因首尾相连随机串联起来，常常用在需要获取足够的DNA片断或基因的表达产物的情况，在此由于hPTH在人体内是通过受体与配体相互结合的方式产生生理作用，药物分子中配体增加，在理论上无疑会使药物与配体结合得机会增加，活性增强。我们可以通过巧妙的设计特异性强的引物，得到纯的二联体基因。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，它除了具有维持血浆渗透压功能以外，还能担当许多内源因子和外源药物的载体，从而调节激素活性，所载物质的毒性，以及药物的利用度。成熟的HSA有585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa，如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量，在正常情况下，不易被肾小球虑过，血浆半衰期在20天左右。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。

发明内容

本发明的一个内容是提供一种集hPTH(1-34)与HSA生理特性于一体的人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白在保持了人甲状旁腺激素生理特性的基础上，增加了作用位点，延长了体内半衰期，改善了溶解度。具有优良的药学特性。

该融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。

本发明的技术方案：设计两组不同的引物从自己实验室保存的pPIC9K-PTH(1-84)-HSA质粒上扩增出两个带有不同5’、3’端延长序列的PTH(1-34)单体，利用重叠PCR技术将二者拼接成二联体，再设计引物从同一质粒上扩增得到成熟HSA的全基因，通过第二次重叠PCR技术将二联体与人血清白蛋白融合，中间不加任何连接肽；得到的为hPTH(1-34)-hPTH(1-34)-HSA cDNA融合基因，将它插入到克隆载体，转化到宿主系统，融合基因就会整合到宿主的染色体中进行表达。各步骤将在实施例中详细讲述。

如此一来，我们制备的人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人甲状旁腺激素(1-34)至少85％序列同源的二联体的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区；所述的与人甲状旁腺激素(1-34)至少85％序列同源的二联体的第一区位于融合蛋白的C末端，与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽；或所述的与人甲状旁腺激素(1-34)至少85％序列同源的二联体的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。优选的是所述的融合蛋白包括与人甲状旁腺激素(1-34)至少95％序列同源的二联体的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。所述的融合蛋白包括与人甲状旁腺激素(1-34)氨基酸残基序列相同的二联体的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述两区的功能等同物。所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、缺失或加入得到的多肽。

本发明hPTH(1-34)二联体和HSA之间不加任何连接肽，可以避免因连接肽的加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。

本发明的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编码区的重组表达载体。