[发明专利]用于治疗心力衰竭的RNA干扰

说明书

发明背景

发明领域

本发明总体涉及治疗心脏疾病的方法，并且更具体地，涉及使用RNAi降低受磷蛋白(PLB)以治疗慢性心力衰竭的方法，包括通过靶向AAV9载体腺伴随病毒(AAV)递送，和诊断对慢性心力衰竭的RNAi治疗的易感性的方法。

背景信息

心力衰竭目前影响超过两百万美国人，并且其经济和人员损失将随着人口的老龄化而继续增加。对于65岁和以上的患者，充血性心力衰竭是最常见的住院患者诊断，每年报道超过400,000新病例。预后差，5年内死亡率60％，并且23-52％的死亡可归因于致死性心律失常(心源性猝死；SCD)。

心力衰竭是心输出量不能满足生理需求。因此心力衰竭不是特殊病，而是代表大多数心脏疾病的终点的综合征，所述心脏疾病包括缺血性心脏病、心肌疾病(舒张性、限制性、或肥大性)、瓣膜性心脏病以及慢性高血压和糖尿病。另外，在如急性心肌梗死、心脏手术后(心肌顿抑、心肌冬眠(hybernation))或再血管化治疗后(即再灌注损伤、溶栓后、经皮穿刺冠状动脉成形术或冠状动脉旁路移植术)的情形中，心力衰竭的症状也可急性呈现(即急性心力衰竭、或心源性休克)。

降低的收缩性是充血性心力衰竭的关键特征，而储存心肌细胞中的钙的肌质网(SR)在心脏收缩性以及兴奋和收缩的偶联中起关键作用。收缩性力的形成依赖于SR中积累的Ca²⁺的量。肌质网钙ATP酶(SERCAa)丰度的增加或受磷蛋白(PLB)磷酸化的增加和/或PLB丰度的降低可促进SR的Ca²⁺摄取的增加，由此增强心肌细胞的收缩性。

PLB是53氨基酸、肌肉特异性磷蛋白。去磷酸化的PLB与SERCA2a结合并调节进入心脏组织的SR中的钙的量。当被蛋白激酶A磷酸化时，SERCA2a的PLB抑制被复活，增加进入SR的钙流量和增强肌肉的收缩性。

心肌基因治疗可用于许多心血管疾病的治疗，所述心血管疾病包括缺血性心肌疾病、充血性心力衰竭和恶性心律失常。用于心肌基因递送的有用载体将允许在直接心肌内注射或输注到冠状动脉或窦中之后有效和稳定地向心肌细胞转导许多转基因。例如，直接注射到左心室心肌的质粒DNA载体已被邻近注射区域的心肌细胞表达6个月。然而，此方法的治疗有用性受到心肌细胞转导效率低(注射区域中0.1％至1.0％的心肌细胞)的限制。

复制缺陷型腺病毒(RDAd)载体的心肌内注射和冠状动脉内输注两种方法已被用于在体内有效转导啮齿动物、兔和猪中的心肌细胞。然而，腺病毒介导的基因转移的可行性受到对病毒和外源转基因蛋白的免疫应答的限制，所述免疫应答引起严重的心肌炎症，感染30天内病毒转导细胞的消除，并由此造成在免疫活性宿主中短暂的重组基因表达。

发明概述

本发明涉及通过调节缺陷的心脏Ca²⁺稳态而治疗严重心力衰竭的靶向RNAi，所述调节是经由使用腺伴随病毒(AAV)转染心肌细胞来降低受磷蛋白(PLB)的表达。该方法还涉及使用所公开的方法在受治疗者中降低室性心律失常、以及全面改善心力衰竭的存活。此外，本发明提供可用于诊断对RNAi治疗的易感性的方法，并包括基本上由降低PLB活性的RNAi组成的药物组合物、试剂盒和载体。

同样地，本发明提供用于治疗受治疗者的心力衰竭的方法。该方法包括向有相应需要的受治疗者施用包括RNAi表达盒的载体，其中所述盒包含其表达产物降低受磷蛋白(PLB)活性的RNAi序列，所述载体的施用是以与施用载体之前相比，有效治疗所述受治疗者的心力衰竭和改善所述受治疗者的收缩功能的量。在一种实施方案中，所述载体是病毒体。在另一种实施方案中，所述载体是质粒。在另一种实施方案中，所述病毒体是细小病毒。在另一种实施方案中，所述细小病毒是腺伴随病毒(AAV)，包括AAV血清型9。在又一种实施方案中，所述RNAi表达盒包括SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。在相关的实施方案中，SEQ ID NO：1的侧翼为AAV末端重复序列。在另一种实施方案中，PLB基因表达被抑制至少10％。在另一种实施方案中，所述RNAi序列包括SEQ ID NO：2所列的靶序列。同样地，所述RNAi表达盒编码至少一个RNA，包括在严格条件下与PLB基因的核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列，和为所述第一核苷酸序列的互补反向重复序列并与所述第一核苷酸序列杂交形成发夹结构的第二核苷酸序列。在一种实施方案中，所述两种核苷酸序列通过RNA环状结构连接。在另一种实施方案中，所述受治疗者是哺乳动物，诸如人类。