[发明专利]发光的镧系(Ⅲ)螯合物、螯合剂及其衍生的轭合物

说明书

发明领域

本发明涉及一组新的螯合剂、新的螯合物、由所述螯合物或螯合 剂标记的生物分子，以及与所述螯合物、螯合剂或标记的生物分子轭 合的固体载体。

发明背景

本文中用于阐明发明背景的出版物和其他材料，尤其是用于为实 践提供额外的详细细节的示例都结合进来作为参考。

在检测中通过将使用期长的发射性镧系(III)螯合物标记或探针 与时间-分辨荧光测定法结合使用，提供了一种产生灵敏的生物亲和力 试验的方法。事实上，基于镧系(III)螯合物的时间-分辨荧光法已经 成为一种成功的检测技术，而且其用在体外诊断中已经有20多年了。 人们已经将以能量从镧系(III)螯合物至非荧光淬灭剂的转移为基础 的时间-分辨荧光淬灭试验应用于不同的水解酶试验以及核酸检测试 验中。铕、铽、镝和钐螯合物的不同的光化学性质甚至能够使人们开 发出多参数的同系试验。

稳定的发光镧系(III)螯合物由具有反应性基团的、用于与生物活 性分子共价轭合的配体，吸收激发能并将其转移至镧系离子的芳族结 构，和另外的螯合基团，例如羧酸或膦酸结构部分和胺组成。与有机 发色团不同，这些分子不经受Raman散射或聚集淬灭。这样就可以实 现多标记化和开发出含有若干个光吸收结构部分的螯合物。

发光的镧系(III)螯合物必须满足若干个要求a)所述分子在基态 和激发态必须都是光化学稳定的，b)所述分子必须是动力学稳定的， c)所述分子必须是化学稳定的，d)激发波长必须尽可能高，优选高于 330nm，e)所述分子在激发波长处必须具有高激发系数，f)从配体至 中心离子的能量转移必须有效，g)发光的衰变时间必须长，h)所述螯 合物应该易溶于水，i)所述生物活性分子在与镧系螯合物偶合之后必 须保留其亲和力。

人们进行了许多努力以调谐适用于时间-分辨荧光计应用的螯合 物标记的光物理性质。这些包括例如，由吡啶衍生物组成的稳定的螯 合物[US4,920,195，US4,801,722，US4,761,481，US4,459,186， EP0770610]、双吡啶[US5,216,134]、三吡啶[US4,859,777， US5,202,423，US5,324,825]，或者作为能量介导基团的各种酚化合物 [US4,670,572，US4,794,191]，和作为螯合部分的多聚羧酸。此外， 还公开了各种二羧酸酯衍生物[US5,032,677，US5,055,578， US4,772,563]、大环穴状化合物[US4,927,923，EP493745A]和大环 Schiff碱[EP369000]。

据显示，以连接于三个苯基乙炔基吡啶基发色团上的1，4，7-三氮杂 环壬烷为基础的铕(III)螯合物具有良好的发光性质：其发光产率(εФ) 显著高于由单发色团构成的螯合物[Helv.Chim.Acta，1996，79，789]； 而且其动力学和热力学稳定性也高。但是，所公开的螯合物不适用于 生物分子的衍生，因为其缺少轭合所需的反应性基团。此外，乙炔基 还易于发生光致褪色，这在基于荧光显微镜术的应用中尤其会产生问 题。所述炔基还可能与体外试验所需的添加剂，尤其是高度亲核的叠 氮化物离子发生反应。后来，通过用呋喃基和三甲氧基苯基亚单元取 代苯基乙炔基以分别产生发光的铕和钐以及铽和镝螯合物而解决了上 述问题[US专利申请11/004,061；US专利申请10/928,143]。

公开的氮杂大环仍具有一些缺点：芳族发色团降低了其在水中的 溶解性。而且，呋喃基衍生物的激发最大值仅仅稍高于300nm；在研 发更简单和更廉价的检测仪器并且降低背景发光信号的显著性的同 时，较高的激发波长是人们所希望的。此外，生物材料，例如核酸和 芳族氨基酸吸收较短的波长。

人们还提出了连接于长波敏化剂上的氮杂大环，例如芳族杂环[例 如，US6,344,360，WO2006/039505，WO2007/055700，J.Chem.Soc. Perkin Trans 2，2002，348]。但是，这类螯合物的发射光谱通常裂 分为若干个峰。进而这样又导致问题：a)如果必须在例如多标记试验 中使用窄的滤波器，则量子产额相对较低，b)在以时间-分辨荧光能转 移为基础的应用中，额外的发射带会产生背景信号，c)强的长波发射 线限制NIR受体的使用。