[发明专利]利用包含体干重的蛋白测量

说明书

发明领域

本发明涉及基于包含体采集物的干重来测定重组蛋白制备中的蛋白产物的方法。

发明背景

在诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌中产生的重组蛋白的高水平表达往往导致在细菌细胞内形成称为包含体的不溶凝聚物(Shein等，Bio/Technology 7：1141-49，1989)。一般而言，包含体蛋白是在宿主中过量表达的蛋白，其在表达或纯化的较末期阶段可通过相差显微镜作为沉淀观察到。包含体是电子致密的无定形颗粒，其与胞质有不连续的分界但并不被膜包围(Schoemaker等，EMBO J 4：775-780，1985)。在制备包含体时，各种类型的相互作用可导致其它污染物(例如内毒素、细胞壁碎片和脂类)的二次吸附(Marston FAO，Biochem.J.240：1-12，1986)。包含体的平均颗粒大小取决于所表达的特定靶蛋白、宿主菌株、表达系统以及所用的培养基，其范围可为0.07μm(人生长激素)(BlumP等，Bio/Technology 10：301-304，1992)至1.5μm(β-内酰胺酶)(Bowden等，Bio/Technology 9：725-730，1991)。包含体的进一步描述可参见美国专利第4,512,922号，其将包含体称为“折射体”。

通常在细胞裂解(例如通过溶菌酶、超声处理或高压匀浆来裂解)后通过数次离心和洗涤的步骤，从细胞裂解液中采集包含体。参见例如美国专利第4,511,503号；第4,518,526号；第5,605,691号和第6,936,699号。随后将纯化的包含体用例如去垢剂或其它溶液(尿素、SDS、盐酸胍)溶解或变性，使不溶蛋白分子解折叠并变得可溶。变性剂随后可例如通过透析或分子筛来移除，或通过高速离心移除分子量更高的组分并滗出变性剂。随后分离出重组蛋白并使其重折叠，以形成有生物活性的正确的高次结构。

为了确保最有效的重折叠反应，控制重折叠反应中蛋白的量和浓度是重要的。从包含体中回收的蛋白通常通过高效液相色谱(HPLC)分析包含体采集物的等分试样来测定。然而，HPLC法的实时分析是个复杂且费时的过程。

因此，本领域仍需要测定重组蛋白制备期间所制备的重组蛋白水平的更加高效且准确的方法。

发明概述

本发明涉及用于测量重组蛋白(细菌)培养物中产生并穿梭至包含体中的蛋白的改良方法。

在一个方面，本发明提供了用于计算细菌的包含体(IB)采集物中重组蛋白浓度的方法，该方法包括在公式中将IB采集浆液等分试样中的干燥固体的总浓度与蛋白生产率换算系数(PPCF)相乘的步骤，其中该公式的乘积提供了所述IB采集浆液的所述等分试样中的总重组蛋白的浓度，并且其中所述重组蛋白的PPCF由IB采集浆液的等分试样通过下述方法测定：将该等分试样中重组蛋白与该等分试样中总干燥固体的比乘以1000。总重组蛋白可依照下式计算：[(总干燥固体，mg)/(IB采集浆液等分试样，g)x PPCF]x总IB采集浆液的重量，g＝(总重组蛋白，mg)。

上述蛋白生产率换算系数可依照下式计算：(PPCF)＝[上述等分试样中重组蛋白(mg)/上述等分试样中总干燥固体(mg)]x1000。

在备选的实施方案中，换算系数可基于待确定的备选单位来计算。例如，浓度可表示为g/kg、g/L、mg/g或mg/ml，并且因为物质的密度非常接近于1，故通常这些浓度是等同的。据此，假设密度接近1g/ml，则用mg/ml表示的浓度相当于用mg/g表示的浓度。

在一个方面，重组蛋白可为以转化细菌(即转化或转染了导致编码异源蛋白的基因表达的重组DNA载体的细菌)中的不溶包含体形式在细菌中表达的任何蛋白。考虑用于本发明的方法的重组蛋白包括但不限于：抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、Fab抗体片段、F(ab′)₂抗体片段、Fv抗体片段、Sc Fv抗体片段或SCA抗体片段、双特异性抗体、双抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体和线性抗体(linear antibody))、酶、激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、跨膜蛋白、细胞表面受体、细胞粘附蛋白、细胞骨架蛋白、融合蛋白或任何以上蛋白的片段或类似物。

在一个实施方案中，将一份包含体采集物等分试样的PPCF用于计算重组蛋白的浓度，所述蛋白来自按照相同方案获得的不同发酵包含体采集物。