[发明专利]永生化禽细胞系

说明书

本发明涉及永生化禽细胞系，以及这些细胞在制备病毒中的用途。本 发明的细胞具体可用于制备重组病毒载体，其可用于制备治疗动物更具体 是人的治疗和/或预防组合物。

真核细胞系是制备病毒疫苗和许多生物技术产品的基础。细胞培养物 中的生物产品包括酶，激素，免疫生物物质(单克隆抗体，白介素，淋巴因 子)，和抗癌剂。尽管许多更简单的蛋白可利用细菌细胞产生，更复杂的糖 基化蛋白质目前必须在真核细胞中制备。

禽细胞多年来已经用于制备病毒载体。例如，用于制备治疗痘症的预 防组合物的痘苗病毒在鸡胚纤维母细胞(CEF)上培养。禽细胞非常有用，这 是由于许多用于药物组合物中的病毒能在其上复制。更值得注意的是，多 种病毒仅能在禽细胞上生长。例如哺乳动物安卡拉病毒(MVA)，其不能在 哺乳动物细胞上生长。这种痘病毒通过将痘苗病毒在CEF上传代500次获 得，用于17世纪早期对免疫缺陷人群进行接种以对抗痘症。现在MVA主 要用作基因治疗目的的载体。例如，MVA用作MUC1基因的载体用于接 种病人对抗表达该抗原的肿瘤(Scholl et al.，2003，J Biomed Biotechnol.， 2003，3，194-201)。携带编码HPV抗原的基因的MVA也用作载体用于治疗 禽肉瘤。最近，MAV作为可选载体来制备针对新出现的疾病或可能的生物 武器诸如西尼罗河病毒和炭疽的预防性治疗。

因此，对病毒制备的需要不断增长。目前，最有用的MVA生产方法 包括在CEF上的病毒复制步骤。但是CEF的应用有很多困难。首先，CEF 的制备包括很多必须人工进行的步骤。

此外，该病毒制备方法有赖于卵的可用性，在繁殖污染的情况下可能 完全破坏。这个问题与禽流感播散越来越相关。

此外，许多CEF具有逆转录酶活性(RT)。RT是逆转录酶复制所需的 酶。逆转录病毒见于许多不同物种。RT在人或动物中不是感染性的，并且 不导致人中的任何不良健康影响。利用高度敏感的基于聚合酶链式反应 (PCR)的测定法，在利用鸡胚纤维母细胞生产的疫苗中检测到微量的RT活 性。该酶的来源很可能是编码RT的部分病毒基因组，据信在数百甚至数 千年之前整合到鸡细胞中。产生这种酶的禽逆转录病毒不影响人。虽然人 免疫缺陷病毒(HIV，导致AIDS的病毒)是逆转录病毒，疫苗中检测的RT 活性绝对不是源自HIV的。此外，RT的检测不能确定逆转录病毒的存在。 然而，没有内源性RT活性的细胞系是感兴趣的。

为了使得病毒制备过程不受CEF使用的约束，需要允许病毒复制和产 生的禽细胞系。永生化细胞系可在生产位点在不同批次中保持或冷冻，并 总是可用于新的制备过程。此外，它们还局限在生产工厂，不容易收到外 源污染物的污染。它们的使用允许制备过程所需的人工操作明显减少。所 有这些性质导致价格降低、生产持续时间缩短以及潜在污染减少。

最后，细胞系可充分表征并且由此完全符合良好的实验室操作以及不 同药剂的要求。

不同禽细胞系已经被描述。例如DF1(US5,879,924)，是自发永生化鸡 细胞系，其衍生自10日龄East Lansing Line(ELL-0)卵。所述细胞可用作病 毒增殖，重组蛋白表达和重组病毒产生的基质。然而，该细胞系容易被多 种病毒感染，所述病毒诸如Meleagrid疱疹病毒1(火鸡疱疹病毒)，鸡痘病 毒，呼肠病毒，禽肉瘤白血病病毒和劳斯肉瘤病毒。

永生禽细胞也可通过逐步从生长因子和喂养层分开而衍生自胚胎干细 胞，由此保持生长特征以及模糊的未分化干细胞的寿命特征。该方法衍生 的唯一的可得禽细胞系是Ebx鸡细胞系(WO2005007840)，其与鼠源喂养层 接触，导致另外的调节问题诸如鼠病毒污染和鸡细胞中内源逆转录病毒序 列的存在。此外，该细胞系在一些条件下不稳定并且易于分化。