[发明专利]经工程改造的酶活性改善的聚唾液酸转移酶

说明书

相关申请的交互参考

本申请要求2007年6月15日提交的美国临时专利申请号60/944,391和 2008年2月29日提交的美国临时专利申请号61/032,589的优先权，此二专利 申请的内容为了所有目的通过引用纳入本文。

发明领域

本发明涉及溶解性和活性改善的的聚-唾液酸转移酶(PST)多肽，以及利用 该聚-唾液酸转移酶产生聚唾液酸终末产物，如寡糖、糖蛋白和糖脂的方法。

发明背景

哺乳动物细胞的细胞表面存在糖蛋白、糖脂和多糖，在许多生物学活动中 是中心分子。它们参与了整个生物学过程中的细胞间识别、细胞分化和各种受 体-配体相互作用。这些生物学活性聚糖中许多都含有必需的9-碳糖，称为唾 液酸或N-乙酰基-神经氨酸(NeuAc)。

某些细菌病原体能入侵哺乳动物宿主是利用了宿主中存在的含唾液酸的 糖偶联物。这些细菌的细胞表面显示有某些相同的糖链，业已证明这些糖在致 病机制中的确具有作用。参见例如，Kahler，C.M和Stephens，D.S.，Crit Rev Microbiol，24:281-334(1998)和Moran，A.P.等，FEMS Immunol Med Microbiol， 16:105-115(1996)。认为存在的这类糖模拟物能使病原菌逃脱免疫系统的监测， 因为这些分子不被认为是异物。另外，存在的这些糖提供了阻止血清补体杀伤 作用的物理屏障。参见例如，Vogel，U等，Med Microbiol Immunol(Brel)， 185:81-87(1996)。最后，有可能某些病原体能利用识别其表面糖结构的人正常 受体作为帮助其传播(或寄居宿主，虽然对于许多这些病原菌而言这种机制未 被证实)的工具。参见例如，Preston，A等，Crit Rev Microbiol，22:139-180(1996) 和Harvey，H.A.等，Mol Microbiol，36:1059-1070(2000)。

B群奈瑟脑膜炎球菌和大肠杆菌K1的夹膜多糖连接键中具有唾液酸，是 主要见于哺乳动物神经细胞粘附分子，一种整合了神经原功能的脑特异性蛋白 中的聚唾液酸(PSA)结构的分子模拟物。发现它们是α-2,8-连接的Neu5Ac的均 聚体，也是α-2,9-连接残基的均聚体，是混合的α-2,8/α-2,9连接键的共聚体， 最后是包含在Y群和W群奈瑟脑膜炎球菌中的其它糖的聚合物。对于大肠杆 菌、奈瑟脑膜炎球菌和溶血性巴斯德菌(P.haemolytica)，神经侵入性疾病需要 这些聚唾液酸夹膜。参见例如，Silver，R.P.和E.R.Vimr.1990，“大肠杆菌K1 的聚唾液酸夹膜”，刊登在B.H.Iglewski和V.L.Clark主编的《微生物发病机制 的分子基础》(“Molecular basis of Microbial Pathogensis”)，第39-60页，哈里弗 圣地亚哥的学术出版社(Academic Press，San Diego，Calif)。重要的是须注意， 因为许多这些病原菌是人宿主特异性的，故动物感染模型获得的数据不能显示 这些糖偶联物所具有的真实功能。

迄今对细菌病原体唾液酸转移酶的酶学基础方面的详细研究极少。已有可 能表达、纯化和结晶负责LOS唾液酸化的一些酶。参见例如，Gilbert，M.等， J Biol Chem，271；28271-28276(1996)；Gilbert，M.等，J Biol Chem，275； 3896-3906(2000)；Chiu，C.P.等，Nat.Struct.Mol.Biol.，11:163-170(2004)和Yu， H.等，J.Am.Chem.Soc.，127:17618-17619(2005)。然而，这些都没有对参与唾 液酸均聚体夹膜生成的那些酶进行研究。

已在大肠杆菌和奈瑟脑膜炎球菌中鉴定到产生PSA夹膜的基因位点，并 对大肠杆菌K1和K92重组酶(NeuS)做了一些研究。参见例如，以Cho，J.和 Troy FA，I.I.，PNAS，91:11427-11431(1994)和Shen，G.J.等，J.Biol.Chem.， 274:35139-35146(1999)。但也还没有关于分离的唾液酸转移酶的详细酶学研究 报告。该酶的溶解性差防碍了体外产生聚唾液酸偶联物因而阻碍了其酶学研 究。本发明解决了此问题和其它需要。

发明概述