[发明专利]适于选择产生目标多肽的文库克隆的表达克隆方法

说明书

序列列表与保藏的微生物

序列列表

本发明包含序列列表。

发明领域

本发明涉及适于筛选可产生目标多肽的文库克隆的表达克隆方法。

发明背景

已经公开了几种在酵母中构建目标多核苷酸序列文库的方法，其中在用选择的多核苷酸转化工业相关的丝状真菌宿主细胞之前，在酵母中筛选文库。

但是通常地，当转化进入与生产相关的丝状真菌细胞中时，通过在酵母或细菌中筛选而鉴定的多核苷酸序列不能表达或者在低水平表达。这可以归于多个原因，包括密码子用途的差别、mRNA水平的调控、转位装置、翻译后修饰机制(例如，半胱氨酸桥、糖基化和酰化模式)等。

A.Aleksenko和A.J.Clutterbuck(1997.Fungal Genetics and Biology21：373-387)公开了自主复制载体或自主复制序列(ARS)用于基因克隆和表达研究的用途。AMA1(在曲霉属中自主维持)是所述质粒复制元件之一。它由基因组重复指定的MATE1(活动的曲霉属转化增强子)的两个反向拷贝组成，两个拷贝由0.3kb中心间隔序列分隔。AMA1促进质粒复制，同时很少进行重排、多聚化或染色体整合。基于AMA1的质粒为在丝状真菌中进行基因克隆和文库生成提供两个优势。第一个是转化的高效率，其可增加潜在的文库大小。第二，通过为基因表达提供相当稳定而标准的环境，转化体的性质将是一致的(WO 00/24883；Novozymes A/S)。

WO 94/11523和WO 01/51646公开了包含完全受损的共有Kozak或“残缺”的共有Kozak序列的表达载体。

WO 03/070956公开了用于表达克隆的克隆载体，其包含AMA-1序列和残缺的翻译启动序列。

如在丝状真菌中的表达克隆目前是本领域标准方法的一部分，然而这种方法的使用是工业相关的，效率、性能或经济上即使微小的增加也是非常令人感兴趣的。

发明概述

理想的是在丝状真菌宿主细胞中筛选多核苷酸文库，获得具有目标性质的多肽，筛选方式可以快速而简单地表征获得的多肽。目前通过在转化入表达宿主细胞后减少表达载体拷贝数的变化来进一步改进WO 03/070956中描述的方法。这已经根据本发明，通过降低表达质粒进入宿主细胞基因组的非同源重组的频率而实现。

本发明的一个方面涉及用于产生目标重组多肽的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供编码一种或多种目标多肽的多核苷酸文库，其中所述文库在包含至少下述元件的表达克隆载体中制备：

i)编码选择性标记的多核苷酸；

ii)真菌复制起始序列，优选自主复制序列(ARS)；和

iii)以连续顺序包含下述的多核苷酸：源自真菌细胞的启动子、可将所述文库克隆入其中的克隆位点，和转录终止子；

b)用所述文库转化亲本丝状真菌宿主细胞的突变体，其中与亲本相比，突变体中非同源重组的频率降低；

c)在适合表达所述多核苷酸文库的条件下培养(b)中获得的经转化的宿主细胞；和

d)选择可产生目标多肽的经转化的宿主细胞。

发明详述

根据本发明，已经发现使用表达克隆方法时的一个潜在问题，即在将文库转入表达载体后不均匀的表达水平使我们更难比较个体克隆的结果，并因此使筛选过程更加困难。几个因素可能产生这种观察到的不均匀表达水平。以前已经通过如上所述改进组成表达载体的元件而解决了这个问题，例如通过将AMA1-序列并入载体或通过使用残缺的“共有”Kozak序列。根据本发明，现在已经发现，通过降低表达宿主细胞中非同源重组的频率可获得显著改善。

在一个方面，本发明因此涉及用于产生目标重组多肽的方法，所述方法包括步骤：

a)提供编码一种或多种目标多肽的多核苷酸文库，其中在包含至少下述元件的表达克隆载体中制备文库：

i)编码选择性标记的多核苷酸；

ii)真菌复制起始序列，优选自主复制序列(ARS)；和

iii)以连续顺序包含下述的多核苷酸：源自真菌细胞的启动子、可将文库克隆入其中的克隆位点，和转录终止子；

b)用所述文库转化亲本丝状真菌宿主细胞的突变体，其中与亲本相比，突变体中非同源重组的频率降低；

c)在适合表达所述多核苷酸文库的条件下培养(b)中获得的经转化的宿主细胞；和

d)选择可产生目标多肽的经转化的宿主细胞。