[发明专利]适于选择产生目标多肽的文库克隆的表达克隆方法

权利要求书

1.用于产生目标重组多肽的方法，所述方法包括步骤：

a)提供编码一种或多种目标多肽的多核苷酸文库，其中在包含至少下述元件的表达克隆载体中制备所述文库：

i)编码选择性标记的多核苷酸；

ii)真菌复制起始序列，优选自主复制序列(ARS)；和

iii)以连续顺序(in sequential order)包含下述的多核苷酸：源自真菌细胞的启动子、可将文库克隆入其中的克隆位点，和转录终止子；

b)用所述文库转化亲本丝状真菌宿主细胞的突变体，其中与亲本相比，突变体中非同源重组的频率降低；

c)在适合表达所述多核苷酸文库的条件下培养(b)中获得的经转化的宿主细胞；和

d)选择产生目标多肽的经转化的宿主细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中所述突变丝状真菌宿主细胞在选自下组的基因座中被修饰：ku70、ku80、rad50、mre11、xrs2、lig4、sir4或它们的功能等同物。

3.根据权利要求2的方法，其中基因座是ku70或ku80或它们的功能等同物。

4.根据权利要求1的方法，其中ARS是AMA1-序列或其功能性衍生物。

5.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述编码标记的序列的翻译启动起始位点包含下述序列：

N YNN ATG

其中位置-3中的“Y”是胸腺嘧啶(尿嘧啶)，“N”是任何核苷酸，并且相对于所述标记的起始密码子“ATG”(以粗体表示)的第一个核苷酸指定数字编号；

6.根据权利要求5的方法，其中序列在位置-1、-2和-4中的一个或多个进一步包含胸腺嘧啶(尿嘧啶)。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤(i)的选择性标记选自下组：amdS、argB、bar、hygB、niaD、pyrG、sC和trpC。

8.根据权利要求7的方法，其中步骤(i)的选择性标记是pyrG或其功能性衍生物。

9.根据权利要求8的方法，其中步骤(i)的选择性标记是pyrG的功能性衍生物，其包含一个或多个氨基酸的取代，优选地，该衍生物包含氨基酸取代T102N。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(ii)的真菌复制起始序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所列的核苷酸序列，或是其功能性衍生物，优选地，该功能性衍生物与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少80％相同。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤(iii)的启动子是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的中性淀粉酶编码基因(NA2)的启动子。

12.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中启动子是NA2tpi启动子。

13.根据权利要求1的方法，其中步骤(iii)的转录终止子是来自黑曲霉的葡糖淀粉酶编码基因(AMG)的终止子。

14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、鬼伞属(Coprinus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliopthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)的丝状真菌宿主细胞。

15.根据权利要求14的方法，其中所述细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的细胞。

16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中目标多肽是酶、酶变体或它们的功能性衍生物。

17.根据权利要求16的方法，其中酶或酶变体是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。