[发明专利]一组重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种CK19重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基 因替换为角蛋白-19基因或其突变型基因得到的重组腺相关病毒载体；其构建方法包 括以下步骤：

A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将pBR-AAV2质粒 中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限 制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质 粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均 插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；

C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长CK19 cDNA和部分CK19 cDNA片段；

D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动 蛋白启动子、全长CK19 cDNA或部分CK19 cDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2 载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启 动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长CK19 cDNA的CK19重组腺相关 病毒载体，命名为rAAV/K19；或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋 白启动子和CK19 cDNA片段的突变型CK19重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/m K19。

2.一种构建权利要求1所述CK19重组腺相关病毒载体的方法，是先将腺相关病 毒载体中的腺相关病毒结构基因剔除，再用所述肿瘤抗原基因或其突变型基因取代该 剔除基因，得到重组腺相关病毒载体，其构建方法包括以下步骤：

A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将pBR-AAV2质粒 中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限 制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质 粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均 插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；

C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长CK19 cDNA和部分CK19 cDNA片段；

D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动 蛋白启动子、全长CK19 cDNA或部分CK19 cDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2 载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启 动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长CK19 cDNA的CK19重组腺相关 病毒载体，命名为rAAV/K19；或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋 白启动子和CK19 cDNA片段的突变型CK19重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/mK19。

3.与权利要求1所述CK19重组腺相关病毒载体相关的重组腺相关病毒颗粒，是 将CK19重组腺相关病毒载体质粒与辅助质粒pHelper共转染AAV-HEK293细胞得到。

4.被权利要求3所述重组腺相关病毒颗粒感染的细胞系。

5.权利要求1所述的CK19重组腺相关病毒载体在制备抗恶性肿瘤药物中的应用， 所述恶性肿瘤为CK19阳性的恶性肿瘤。

6.权利要求3所述的病毒颗粒或权利要求4所述细胞系在制备抗恶性肿瘤药物 中的应用，所述恶性肿瘤为CK19阳性的恶性肿瘤。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述CK19阳性的恶性肿瘤为 鼻咽癌、宫颈癌和肺鳞癌。