[发明专利]重组人FUS1和人IL－12的双基因表达载体、脂质体复合物及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及人FUS1和人hIL-12的双基因真核共表达重组质粒载体构建，其阳离子脂质体复合物的制备方法和用途。

背景技术

肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤。也是全世界发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。目前，肺癌发病率和死亡率在男性均占第一位，在女性发病率占第2位，而死亡率占第一位，肺癌已成为人类的第一杀手。据WHO最新统计，每年全世界估计有超过200万新肺癌患者，死亡约180万人^[1]。我国形势更为严峻。20世纪70年代以来的30年间，我国肿瘤死亡率呈明显上升趋势，70-90年代的20年间，肿瘤总的死亡率上升约30％，而肺癌死亡率上升幅度最为显著，达到111.85％，进入21世纪，肺癌已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位。肺癌给患者本人及家庭造成极大痛苦，也占用了大量的社会资源和财富，肺癌已经成为人类面临的日益严重的公共卫生问题。各国政府都投入了大量的人力和物力，以期在肺癌研究领域有所突破。

FUS1是在肺癌中新近发现的一种肿瘤抑癌基因，位于人类染色体3p21.3区，基因序列长3.3kb，含有3个外显子，编码110个氨基酸^[2]。野生型FUS1是一种N-十四烷酰化的蛋白，FUS1基因的抑癌活性与蛋白质的N-十四烷酰化有关，FUS1蛋白的豆蔻酰化缺失突变使它丧失了抑制肺癌细胞生长、诱导肺癌细胞凋亡和抑制肺癌转移的作用^[3]。最近的研究发现在100％的小细胞肺癌和82％的非小细胞病人中存在FUS1基因的表达异常^[4]。体外实验证明FUS1基因转染肺癌细胞能明显诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的生长，通过瘤内注入脂质体包裹FUS1基因复合物，在动物体内能明显抑制肺癌H1299和A549细胞皮下移植瘤；通过静脉注射脂质体包裹的FUS1基因复合物至A549转移模型的小鼠能够明显减少肺部肿瘤转移灶的数量^[5]。美国Anderson Cancer近期研究结果报道^[6]，脂质体包裹FUS1基因复合物的I期临床实验取得了很好的结果，在I期临床试验中处理了十三个病人，并未发现任何与药物相关的明显毒性。所有治疗的病人的中位生存期达到14.6月，而那些接受肺癌二线化疗药物治疗的肺癌病人，其中位生存期仅为7个月。在I期临床试验中未发现脂质体包裹FUS1基因的最大耐受剂量，进一步的临床试验尚在进行中。这些研究表明FUS1基因是一种很好的肿瘤转移抑制基因。此外，研究发现FUS1基因是肺癌发生过程中的早期基因，对于早期肺癌的发生和转移均具有很好的治疗前景。因此，FUS1基因在肺癌的发生和治疗中具有非常重要的作用，FUS1基因的异常有可能成为肺癌分子治疗的新突破点^[7]。

众所周知，白细胞介素12(又名N K细胞刺激因子和CTL成熟因子)，是诱导细胞免疫的关键细胞因子，能显著促进NK细胞、T细胞增殖，促进细胞毒T细胞(CTL)细胞的应答能力，诱导T细胞和NK细胞分泌IFN-γ，促使Th细胞向Th1细胞分化等多种生物学活性^[8]。近年来，大量的动物实验证明IL-12具有强大的抗瘤活性、抗转移作用以及延长荷瘤动物的生存时间^[9]。鉴于IL-12的直接应用给机体带来了不同程度的毒副作用(发热、寒颤、恶心、呕吐等)，人们尝试着通过基因转染技术增强机体抗瘤免疫功能，以达到治疗肿瘤的目的。IL-12抗肿瘤的研究在美国已进入临床I期实验^[10，11]。目前，IL-12基因治疗概括起来主要有两种方案：体外免疫基因治疗方案和体内基因治疗方案。在体内基因治疗方案中，将携带IL-12基因的载体直接注射到肿瘤部位，以达到抑制肿瘤生长或使肿瘤完全消退、阻止恶性转移、抑制远处肿瘤生长的目的.将携带IL212基因的载体直接注射到肿瘤部位，以达到抑制肿瘤生长或使肿瘤完全消退、阻止恶性转移、抑制远处肿瘤生长的目的。目前面临的主要问题是如何选用合适的载体将治疗基因有效地导入体内或肿瘤内，在此方面很多学者先后进行多种尝试，研究使用的载体主要有质粒载体、病毒载体、非病毒载体等。