[发明专利]一种B19病毒VP1独特区基因

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及B19病毒基因的克隆，特别涉及一种B19病毒VP1独特区的新基因片段的克隆，并构建原核表达载体、表达纯化获得有免疫原性的重组蛋白VP1独特区。 

背景技术

1.B19病毒及其致病性 

人细小病毒B19(Human Parvovirus B19，PVB19)是1975年Cossart YE用对流免疫电泳法筛选健康献血者血液中乙型肝炎病毒时于第19号标本中偶然发现的，因此得名。它是细小病毒科细小病毒属中目前己知的唯一致人类疾病的病毒，也是动物病毒中体积最小结构最简单的DNA病毒。1981年，在患镰状细胞贫血和再生障碍性贫血的儿童中检测到这种病毒，从而证实了其致病性，以后又相继在传染性红斑(又称第五病)、血小板减少性紫癜、关节病、心肌炎、心包炎、急性肝炎患者中检测到该病毒，而且还发现该病毒能通过胎盘感染胎儿，引起孕妇流产、早产或胎儿水肿、死胎。1987年在1例先天性免疫缺陷综合征贫血病人中证实存在有慢性B19病毒感染。随后的研究显示在AIDS患者、器官移植的受者、化疗的肿瘤病人等免疫抑制患者中都有慢性持续性B19病毒感染的存在。近年来，还证实B19病毒感染与川崎病、一过性成红细胞减少、系统性红斑狼疮、皮肌炎、慢性自身免疫性血小板/中性粒细胞减少症、某些严重的肝炎、由免疫复合物介导的肾脏损害及睾丸生殖细胞瘤等疾病有关，甚至可引起败血症。 

张国成等于1990年首次从育龄妇女及儿童中检测出B19病毒特异性抗体，证实我国存在B19病毒感染。随后在国内率先展开了对B19病毒与疾病 的关系、B19病毒感染的诊断、治疗及预防等方面的研究，陆续发现并报道了B19病毒是我国孕妇非免疫性流产、儿童急性再障危象、急性血小板减少性紫瘫等疾病的重要病因之一。张国成等对自然流产的胚胎组织和先天性心脏患儿的心肌组织标本进行B19病毒DNA和IgM检测，提示B19病毒宫内感染可能与自然流产和先天性心脏病的发生有一定关系；并通过PCR，RT-PCR及ISH等分子生物学技术检测先心病心肌组织中的B19病毒基因，发现有较高的阳性率，其主要分布在心肌细胞核内，提示B19病毒可能是先天性心脏病发病的重要病原，参与了核酸的表达而影响心脏的发育，导致了心脏畸形。 

B19病毒的传播途径主要通过呼吸道、血液制品和母婴垂直传播，高效价的病毒血症使经血液或血制品传播的可能性增加。在自愿献血员中，B19病毒的检出率为1:167至1:35000，主要分布于17-45岁，以1-39岁最为明显。在中国，献血员中B19病毒的检出率为5.08％。 

2.B19病毒的结构特征及分型 

B19病毒颗粒由两个衣壳蛋白和一条线状的单链DNA分子组成，呈对称的二十面立体结构，无包膜，直径22-24nm，平均23nm。在电镜和阴性染色中可见空壳和完整的病毒颗粒，成熟的有感染力的病毒颗粒分子量为5.6×10⁶道尔顿，其中DNA占全重的一半。B19病毒基因为单链小DNA，全长5596bp，两端有383bp长的重复序列形成复式发卡结构，G、C含量高，具有强同源性，是合成整条链的引物。两端的复式发卡结构使得B19病毒基因二级结构牢固，而不易克隆入细菌中。在B19病毒基因组内有两个大的开放读框，几乎延伸整个基因组，左侧的开放读框(406-2501bp)编码非结构蛋白(NS)，右侧的开放读框编码两个衣壳蛋白VP1和VP2。VP2的氨基酸编码序列(3088-5093bp)包含在VP1的氨基酸编码序列(2416-5093bp)中，其组成比后者少226个氨基酸的氨基尾，故这两种衣壳蛋白在氨基酸组成上具有同一性。VP1蛋白中不包含VP2蛋白的区域称为VP1独特区蛋白区。VP1和VP2组成衣壳包裹在B19 病毒DNA表面，构成B19病毒的抗原性，其中95％由VP2组成，VP1仅占5％。病毒的主要中和抗原表位位于VP1独特区和VP1-VP2连接区。虽然VP1的量比VP2少，但是VP1独特区对于形成成熟的B19病毒壳粒至关重要，VP1的大部分片段延伸到衣壳外部，是刺激机体产生中和性抗体的主要抗原，更容易与抗体结合。