[发明专利]一种靶向粘附壳聚糖材料及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗的核酸药物，具体地说是应用一种具有靶向粘附 性的天然多糖材料制备成纳米载体，能有效保护和靶向性运输核酸药物进 入细胞，并实现释放。

背景技术

基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。 基因治疗有3个基本要素：目的基因、表达载体和递送载体。以RNA[dsRNA 或小RNA(siRNA、microRNA或shRNA)]为目的基因介导的RNA干扰(RNA interference)是特异性结合与其序列互补的信使RNA(mRNA)，经核酸酶降 解mRNA而阻断其编码蛋白质的表达，实现基因沉默，因而在癌症和流感、 肝炎等病毒感染疾病治疗领域有重要的科学意义和应用价值。但裸的小 RNA血液稳定性差、难以进入细胞且可引起非特异性免疫刺激，而限制了 其临床应用。同样，以质粒DNA为表达载体包装siRNA形成的shRNA能否 安全有效地运载基因到指定地点决定了基因治疗在临床上应用的成败。

为解决DNA或RNA的递送这一瓶颈问题，近年来人们开展了基因递送 方法和递送载体的研究。其中基因枪法、电穿孔法、声穿孔法、激光照射 法、磁转换法等物理和机械运输方法存在组织穿透力差、毒性及侵蚀性、 潜在副作用、效率低等缺陷。而腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病 毒等病毒载体又有免疫原性强、基因装载量小、制备工艺复杂、价格昂贵、 纯化及质量监控困难、潜在的毒性和致癌性、靶向特异性差、储藏不稳定 等弊病。普遍使用的非病毒载体中的阳离子脂质体经静脉注射进入体内后， 首先与血清蛋白结合，易被单核巨噬细胞作为异物吞噬，很难进入靶细胞， 其本身也具有一定毒性，制备产率低。其它非病毒载体如聚乙烯亚胺、聚 赖氨酸等也存在着稳定性差和毒性等不足。通过对比发现，胶原、壳聚糖 等天然材料是优良的基因载体，但转染效率较低的缺点阻碍了其进一步在 基因治疗中的应用。

壳聚糖作为天然多糖中唯一的碱性多糖，除具有生物相容性好、可生 物降解，无毒等特点之外，比胶原还有着潜在的物理化学修饰性，可以通 过增加靶向修饰而提高基因的转染效率。然而通常氨基较羟基的反应活性 更高，常被利用作为接枝反应位点，以牺牲壳聚糖分子链上的部分氨基为 代价就是牺牲了壳聚糖独有的生物活性，也影响了它作为载体的基因容量。

因此，本发明应用一种新型羟基选择性修饰的靶向粘附壳聚糖改性材 料作为基因载体，赋予了壳聚糖载体新的靶向粘附功能，克服同类靶向材 料利用EDC、NHS接枝在氨基，占用基因容量、影响接枝效率的不足(粘附 肽同时具有氨基和羧基，也容易自我连接，增大空间位阻)；也克服了同类 靶向材料作为载体的毒性问题[Nucleic Acids Research，2004，32(19)，e149]。 并且通过接枝亲水性肽，增强了壳聚糖在近中性环境下的溶解性。

发明内容

本发明目的在于提供一种新型羟基选择性修饰的靶向粘附壳聚糖材料 的应用，本发明把一种易于制备、稳定、生物相容性好、有生物活性、安 全(无毒、可降解)、可溶解的靶向粘附壳聚糖材料，应用作为DNA、RNA 等核酸药物的纳米载体，以增强对其保护作用和靶向粘附肿瘤细胞的运输， 使其更好地实现基因治疗功能。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为；

一种靶向粘附壳聚糖材料的应用，首先经光化学激活的基团选择性接 枝细胞粘附性肽得到的改性壳聚糖材料，再与带负电荷的DNA(20bp-10kb) 和RNA[dsRNA(500-700bp)、小RNA(siRNA、microRNA或shRNA)]等核酸 药物通过自组装的方法制备成粒径在100-500nm、表面荷正电10-30mV的 纳米颗粒，转染细胞并实现释放，达到疾病治疗效果。

所述细胞粘附肽为含有细胞粘附因子RGD(Arg-Gly-Asp)序列的多肽 GRGDY，RGD作为整合素的受体，其选择性部分依赖于RGD的构象以及 RGD周围的氨基酸残基；其序列为：RGD四肽、五肽、六肽、RGD环肽、 双线肽或RGD模拟肽，肽链长度范围在3-12个氨基酸残基，它们均可以 采用所述方法接枝到壳聚糖上，都是采用光敏性交联剂的-NHS酯键断裂与 肽链的-NH₂发生反应重新生成酰胺键，可制备出安全、无毒、可降解、生 物相容性好、有生物学功能、在弱酸性条件下溶解的靶向粘附壳聚糖材料； 其结构单元为：