[发明专利]诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及诱导细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导肝卵圆细胞 向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。

背景技术

WB-F344细胞是一类从Fischer雄鼠肝脏分离出来的细胞，具有许多肝干/祖细胞 的特性：1)它具有肝细胞和肝胆管细胞的表型特征；2)当它移植到大鼠的肝脏中后， 它能够获得肝细胞的型态和功能特征；3)WB-F344细胞经过化学诱变后移植入大鼠肝 脏后能够发展成为胆管癌，表明它具有向胆管细胞分化的潜能，这些特征都说明 WB-F344细胞是肝干/祖细胞。有研究发现，丁酸钠处理后的WB-F344细胞具有了胆管 细胞的一系列标志，说明WB-F344可在丁酸钠的诱导下向胆管细胞分化。此外，还有研 究发现，把WB-F344细胞培养在Matrigel上时，细胞的生长开始停滞，细胞形成管腔 样结构，细胞开始收缩并沿管腔结构方向拉伸，细胞的核质比变大。对诱导的细胞进行 mRNA和蛋白水平检测发现，胆管细胞的标志如CK19、Yp、aquaporin以及BDS7等的表 达量都不同程度的上调。

小G蛋白Rho家族主要的生物学效应是引起肌动蛋白细丝等细胞骨架蛋白重构，从 而维持细胞的形态极性，促进细胞的变形、趋化运动和游走，此外，Rho家族成员也参 与对细胞周期的调控、细胞应激反应的调节等。在生物发育的过程中，具有多向分化潜 能干细胞的定向分化起着决定性作用，它们促成了胚胎发生、神经发生、造血生成、骨 生成及肌肉生成等生物学过程，而在这些分化发育的过程中，小G蛋白家族尤其是RhoA 蛋白起到至关重要的作用。研究发现，在传统生物学模型果蝇(Drosophila)的胚胎发 育过程中，RhoA的缺乏会导致原肠胚形成的受阻，同时细胞失去运动能力；此外，在 果蝇的神经发生过程中，神经母细胞的增殖和树突的形成也受到RhoA的调控，当RhoA 失活时，果蝇的神经发生受到抑制。Li Wei等在小鼠胚胎的发育过程中，用RhoGDI表 达来抑制RhoA的激活，发现RhoA的失活会导致发育7天的小鼠胚胎死亡(Wei L， Imanaka-Yoshida K，Wang L，et al.Inhibition of Rho family GTPases by Rho GDP dissociation inhibitor disrupts cardiac morphogenesis and inhibits cardiomyocyte proliferation.Development，2002，129(7)：1705～1714)；另一方面， 在脊椎动物胚胎发育过程中，RhoA的过量表达也会导致胚胎体积的减小甚至胚胎的死 亡。在早期胚胎发育的神经发生过程中，轴突的起始与生长、细胞的极化、神经元的再 生都受到Cdc42和Rac的调控，此外，RhoA的抑制会阻碍神经系统形成，而RhoA活性 的逐步下调引发皮层神经细胞的迁移。同样，在造血系统发育过程中，RhoA也参与了 造血干细胞的细胞迁移和运动，抑制RhoA的活性会促进造血干细胞的迁移、粘附和重 建研究还发现，在间充质干细胞的分化决定过程中，间充质干细胞与不同的分化细胞如 平滑肌细胞和血管内皮细胞接触培养时，会呈现不同的细胞状态，此外，结合间充质干 细胞本身的细胞形态、应力等，RhoA蛋白的失活突变会促进间充质干细胞向脂肪细胞 分化，相反的大量活性RhoA蛋白则诱导间充质干细胞向肌肉或者成骨细胞分化。 Sordella的研究发现小鼠的表皮成纤维细胞能够在p190GAP和RhoA的作用下调控着向 成肌肉和脂肪细胞分化(Sordella R，Jiang W，Chen GC，et al.Modulation of Rho GTPase Signaling Regulates a Switch between Adipogenesis and Myogenesis.Cell， 2003，113：147-158)。总而言之，在干细胞的分化发育过程中，RhoA在维持着细胞 基本运动特性的同时，还对干细胞的自我更新、分化决定以及定向分化过程中起着调控 作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行的用于体外诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的 专用培养基。