[发明专利]一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法。

背景技术

随着原子力显微镜(AFM)和微机电系统(MEMS)的出现，微悬臂梁传感技术 迅速发展成为一种新的传感方法，其原理是：当微悬臂梁表面发生生化反应时会产 生表面应力的改变，从而导致微悬臂梁产生弯曲变形，结合光学或电学方法监测这 种变形，就可以知道整个生化反应进行过程的信息。通过依靠免疫特异性识别建立 的微悬臂梁免疫传感技术与传统的酶联免疫吸附测定技术(ELISA)相比，该项技 术在检测时无需对待测样品进行标记，消除了可能由标记产生的附加影响，且灵敏 度高，可实现实时、并行的监测整个生化反应的发生过程，从而得到更丰富的生物 信息，容易实现大尺度、高通量、平行阵列测量的显著优势，特别适用于难于标记 的示踪物，如荧光素或示踪同位素的被检测靶分子。近年来，微悬臂梁免疫传感技 术在癌症检测、DNA杂交和转录因子等方面都得到了广泛的应用。

微悬臂梁免疫传感技术应用的关键，是如何将灵敏度高、特异性强的抗体有效 的结合到微悬臂梁的金膜上并尽量保持抗体的活性。关于将抗体固定到微悬臂梁上 对微悬臂梁进行修饰的方法，国内外文献报道的方法主要是通过具有双功能基团的 巯基化试剂进行的，主要方法有以下两类：第一类方法是先将巯基化试剂结合到微 悬臂梁上，然后活化巯基化试剂上的羧基或氨基，使之与抗体上的氨基或羧基结合， 所用巯基化试剂如11-羧酸硫醇(11-MUA)、2-氨基乙硫醇(AET)或3-巯基丙酸(MPA)。 这类办法增加了活化步骤，影响抗体固定的稳定性与一致性，同时会使抗体的活性 降低，结果的重复性较差；另外，巯基化试剂活化后与抗体反应持续的时间也较长， 一般需要3-5小时左右。第二类方法是先将抗体进行巯基化，然后再结合到微悬臂 梁的金膜上，巯基化试剂以磺基羟基琥珀酰亚胺基-6-(3’，2-吡啶二硫-丙酰胺)- 己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)和3，3’-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)为主。 这类办法的原理是在抗体与巯基化试剂反应后形成二硫键，再加入二硫苏糖醇 (DTT)还原出自由巯基，其缺点是由于抗体的重链与重链之间以及重链与轻链之 间有许多二硫键，用DTT还原时可能会破坏抗体的结构进而影响抗体的活性和微悬 臂梁传感器的检测极限。此外，杯芳冠醚(Calixarene)衍生物Prolinker^TM等已在国 外被申请专利。

发明内容

本发明的目的是提供盐酸硫醇亚胺的一种新用途。

本发明所提供的盐酸硫醇亚胺的新用途是其作为巯基化试剂在制备修饰有抗 体的微悬臂梁中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法。

本发明所提供的制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法，是以盐酸硫醇亚胺为巯基 化试剂，对抗体进行巯基化，得到巯基化抗体，再将所述巯基化抗体固定到带有金 膜的微悬臂梁上，得到修饰有抗体的微悬臂梁

上述方法中，所述抗体和所述盐酸硫醇亚胺的摩尔比为1:(1-6)，具体为1:3。

上述方法中，所述抗体可为鼠、兔等动物源的多克隆抗体或单克隆抗体等，如 抗克伦特罗单克隆抗体。

可用现有的巯基化方法，利用所述巯基化试剂-盐酸硫醇亚胺对抗体进行巯基 化。具体制备时，所述抗体和所述盐酸硫醇亚胺的反应条件为，室温下反应0.5-2.0 h，具体可为室温下反应1h。

所述将巯基化抗体固定到微悬臂梁的金膜上的反应条件为，30.0-37.5℃反应 0.5-2.0h，具体可为37℃反应1h。

利用上述任一方法制备的修饰有抗体的微悬臂梁也属于本发明的保护范围。

鉴于微悬臂梁免疫传感技术对抗体固定的重要性，本发明将盐酸硫醇亚胺作为 巯基化试剂与抗体结合，然后将巯基化后的抗体固定到微悬臂梁上。结果表明，通 过巯基化试剂-盐酸硫醇亚胺的引入，本发明的将抗体固定到微悬臂梁上的方法与 现有的方法相比具有反应时间短、操作简单、抗体活性损失少等优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的将抗体固定到微悬臂梁上的方法做进一步说 明，但不限制本发明。

实施例1、制备修饰有抗体的微悬臂梁

1、利用盐酸硫醇亚胺将抗体巯基化