[发明专利]检测百菌清农药残留的方法及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测果蔬中百菌清农药残留的方法，以及百菌清ELISA检测试剂盒， 同时，本发明还涉及百菌清人工完全抗原的制备方法和百菌清多克隆抗体，属于酶联免疫 分析技术领域。

背景技术

百菌清(chlorothalonil)是一种广谱性杀菌剂，在植物表面有良好的黏着性，不易受雨水 冲刷，药效稳定。其纯品为白色结晶，无臭味，不溶于水，微溶于丙酮等有机溶剂，对高等动 物低毒，但对鱼类及甲壳类动物毒性较大，主要用于防治蔬菜的霜霉病、炭疽病、疫病等(农 业部农药检定所.新编农药手册[M].北京：农业出版社，1989，316-317.)。

我国无公害蔬菜中规定百菌清残留量不得超过1mg/kg，欧盟则规定百菌清的残留不能 高于0.01mg/kg(中国标准出版社第一编辑室.无公害食品标准汇编，蔬菜卷[M].北京： 中国标准出版社，2003，第1版，41.)。现有的检测方法主要了色谱法、光谱法、色谱-质 谱联用技术、色谱-光谱联用法、多维气相色谱技术、毛细管电泳法等(康长安，何娟，杨 柳，高会云，刘德仓，卢奎.色谱、光谱及联用技术在多农药残留检测中的应用.环境监测管 理与技术.2007，19(4)：9-13，31；李海燕，施银桃，曾庆福.毛细管电泳法直接测定化工废 水中邻苯二甲酸二丁酯[J].环境监测管理与技术，2006，18(4):19-20.)在实验室进行。 应用这些理化技术对粮油、果蔬样品中痕量的百菌清残留进行分析，其仪器化程度要求高， 而且要经过繁琐的分离、提取、净化、衍生等前处理，分析速度慢且成本高。随着待检样 品量的增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，研制开发一种快速、高效、 廉价的百菌清检测方法就显得尤为重要。

80年代以来，免疫学技术在农药残留中的检测应用越来越深入，ELISA法测定农药 残留以其特异性强、灵敏度高及快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、 食品中的农药残留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。有关ELISA法检 定农残的试剂盒层出不穷，但关于检测百菌清的ELISA试剂盒还未见报道。本发明百菌清 ELISA检测试剂盒的研制填补了国内空白。

发明内容

本发明的目的是研制开发一种检测果蔬中百菌清农药残留的ELISA试剂盒及用该试剂 盒检测果蔬中百菌清农药残留的方法，该方法能够快速、高效地检测果蔬中百菌清的农药 残留，而且成本廉价。同时，本发明还提供百菌清人工完全抗原的制备方法和百菌清多克 隆抗体。

本发明提供的技术方案是：一种百菌清人工完全抗原的制备方法，包括如下步骤：

1)将百菌清和氟化钾溶解于乙二醇溶液中，油浴反应；

2)将反应液冷却到室温后，倾入冰水中，沉淀完全后，经后处理得白色粉末，即为半 抗原；

3)将上述半抗原溶解于DMF中，再加入咪唑酮进行反应，加入牛血清白蛋白，搅拌；

4)进行透析，离心，干燥，获得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。

其中，半抗原的具体合成过程是：一定量的百菌清(干燥)和氟化钾溶解于乙二醇溶液 中，在搅拌下，90℃油浴，36小时停止反应，将反应液冷却到室温后，倾入适量冰水中， 沉淀完全后，经后处理得白色粉末，将获得的白色粉末于硅胶柱(300-400目)层析得目 标产物2，4，5-三氯-6-(2-羟基乙氧基)间苯二腈，即半抗原。

人工完全抗原的具体合成过程是：将获得的上述半抗原(白色粉末)适量溶解于适量 DMF中，于室温搅拌，使其完全溶解，再加入适量咪唑酮，于室温缓慢搅拌3h；于上述 反应液中加入适量牛血清白蛋白，再加入适量pH7.4PBS，于4℃搅拌14h左右；透析， 离心，干燥，获得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。

一种百菌清多克隆抗体，由上述方法制备的百菌清人工完全抗原免疫动物得到，其中， 免疫动物优选家兔。

一种ELISA检测百菌清农药残留的方法，采用上述的百菌清多克隆抗体作为一抗。

所述的ELISA检测百菌清农药残留的方法，包括如下步骤：

(1)抗原包被：对待测样品进行包被；

(2)封闭：用封闭液进行封闭；

(3)加一抗：加入权利要求2的多克隆抗体；

(4)加入酶标羊抗兔二抗，进行孵育；