[发明专利]一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分化，具体涉及一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法。

背景技术

哺乳动物的视网膜神经节细胞损伤后难以再生，临床上，多种眼科疾病，包括青光眼、缺血性视神经病变等均可引起视网膜神经节细胞损伤，最终导致不可逆性眼盲。干细胞替代治疗的研究为治疗此类疾病带来了新的希望。视网膜神经前体/祖细胞(RPCs)属于发育不成熟的视网膜细胞，体外实验和动物实验表明，将其移植到受体视网膜后，其能够在视网膜内整合并分化为成熟的视网膜神经细胞，使受体动物的视功能得以明显恢复。研究发现，对某一特定类型的视网膜神经细胞(如视杆细胞)缺失，其相应的前体细胞有更好的替代治疗效果。尽管视网膜神经前体细胞展现出良好的治疗潜能，但由于自体或异体来源的视网膜神经前体细胞非常有限，使得相应的临床研究和应用难以展开。

目前，已有研究将小鼠和人的胚胎干细胞诱导分化为视网膜神经前体细胞，使获得大量的视网膜神经前体细胞成为可能，然而，异体来源的胚胎干细胞存在免疫排斥反应、成瘤性及伦理学限制等问题，限制了其临床应用。

骨髓间充质干细胞(BMSCs)取材方便，容易扩增，具有多向分化潜能，诱导分化后可进行自体移植，从而可避免免疫排斥反应和伦理学问题。将骨髓间充质干细胞诱导分化为视网膜神经节样前体细胞，能为青光眼、缺血性视神经病变等视网膜神经节细胞相关疾病提供种子细胞，为下一步的细胞移植治疗打下基础。

诱导骨髓间充质干细胞分化的方法很多，包括生长因子诱导、化学物质诱导、转基因诱导及共培养诱导等。本发明采用了与孕龄13-14天的小鼠视网膜神经前体细胞共培养的诱导方法，之所以选择孕13-14天，是因为这个时期，小鼠视网膜神经节细胞发育快，视网膜微环境有利于视网膜神经节细胞的产生。此诱导方案目前未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法，主要包括以下步骤：

1.用含体积百分比为8％-12％的胎牛血清和0.8-1.2％GlutaMAX的DMEM/F12生长液，培养野生型小鼠及EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞；

2.取孕龄13-14天的小鼠，分离出神经视网膜组织，TrypLE Express消化后，用无血清神经生长液进行视网膜神经前体细胞的原代培养；

3.用Transwell分层共培养体系，将步骤(1)中培养的第3-5代的骨髓间充质干细胞与步骤(2)所述新鲜取材的视网膜神经前体细胞进行非接触分层共培养，骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞的细胞个数比例为1∶15-25，培养液采用无血清的神经生长液；培养3-21天后，取骨髓间充质干细胞，检测其基因表达，得到视网膜神经节样前体细胞；和/或

4.将步骤(1)中培养的小鼠骨髓间充质干细胞，与步骤(2)所述新鲜取材的视网膜神经前体细胞进行混合，细胞个数混合比例为1∶15-25，离心去上清后，用无血清神经生长液进行混合共培养，培养6-7d后，用免疫荧光对骨髓间充质干细胞进行蛋白表达检测，得到视网膜神经节样前体细胞。

优选地，步骤(2)中，小鼠的孕龄为13.5天；步骤(3)和步骤(4)中，骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞共培养的细胞个数比例为1∶20。

神经细胞生长液的组成包括：以DMEM/F12为基础培养基，再加入终浓度为20ng/ml的EGF，终浓度为20ng/ml的bFGF，体积百分比为1％的N2 Supplement，体积百分比为2％的B27 Supplement及体积百分比为1％的GlutaMAX。

为诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样前体细胞，本发明采取了将骨髓间充质干细胞与新鲜取材的孕龄13-14天(特别是13.5天)的小鼠视网膜神经前体细胞进行共培养的诱导方法。该方法简单、易行，诱导效率高，不需转入外源基因，具有安全、实用的优点。

附图说明

图1为传代培养的野生型小鼠骨髓间充质干细胞(A)和EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞(B)；

图2为原代培养的孕13.5天小鼠视网膜神经前体细胞(A)及其基因表达情况(B)；

图3为野生型骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞(孕龄13.5天)分层共培养示意图；

图4为与视网膜神经前体细胞分层共培养前后，骨髓间充质干细胞的形态及基因表达情况；