[发明专利]核酸扩增用器件

说明书

技术领域

本发明涉及基因解析技术。更详细地讲，涉及核酸扩增用器件，所述核酸 扩增用器件在独立地在微珠等固相表面对作为测定对象的mRNA等靶分子进 行扩增时，使这些靶分子的利用率提高，消除靶分子的混合或过度扩增。

背景技术

在基因序列解析技术中，对于作为测定对象的mRNA或DNA片段等靶分 子，在保存其序列信息的状态下对其进行扩增是重要的技术。作为其一例，有 利用焦磷酸测序(Pyrosequencing)的序列解析系统(非专利文献1)。该系统 中，为了使作为测定对象的靶分子在1个微珠表面上仅为1种，需要实现靶分 子的独立扩增。

另一方面，还有利用通过油中的水溶液胶束进行的分离作为实现独立扩增 的要素技术的方法(非专利文献2)。该方法中，通过2相(水相、油相)的 搅拌，形成水溶液胶束，在该胶束内保持微珠、靶分子和核酸扩增所需要的一 组试剂等，通过扩增仪在微珠表面扩增核酸。因此，理想的情况是在1个胶束 内放入微珠和靶分子各1个。但是，对于全部胶束，实现这样的条件是不可能 的，通常存在如下情况，即，有微珠但不含靶分子的胶束、反之有靶分子但没 有微珠的胶束、进而放入有多个微珠和靶分子的胶束、微珠和靶分子都没有放 入的胶束等(非专利文献2)。在1个胶束内放入有多个靶分子的情况下，扩 增时发生它们的混合存在，使序列解析成为不可能。另外，尽管胶束中存在靶 分子，但在没有放入微珠的情况下，靶分子不能在微珠表面扩增，导致靶分子 的损失。进而，在胶束内放入有多个微珠的情况下，由于来自相同靶分子的扩 增在多个微珠表面发生，因此产生过度解析的问题。

进而，还报告有在载玻片等平板表面上生成部分的聚集区域(集落)的扩 增方法(非专利文献3)。该方法是，使用在平板上固定有扩增用引物的物质， 以确保某种距离的浓度分布使靶分子与平板上的引物进行互补链结合，之后， 利用周边的引物，反复进行引物延伸和桥状的互补链结合，从而形成扩增物质 的集落。该方法的问题是，由于对平面上的引物的互补链结合的效率低，因此 需要过量的靶分子，并且如果多个靶分子接近进行互补链结合时，则扩增物的 集落结合，发生混合。

非专利文献1：NATURE，Vol.437，pp.376-380(2005)

非专利文献2：PNAS，Vol.100，No.15，p8817-8822(2003)

非专利文献3：Cell，Vol.129，p823-837(2007)

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，现有技术中，就靶分子的扩增来说，存在如下问题：(1)由于 水滴(胶束)内没有微珠，因此不能对该胶束内的靶分子进行解析；(2)胶束 内存在多个微珠，生成多个固定来自靶分子的扩增产物的微珠，形成过度解析。 因此，在称为扩增工序的解析前处理的前后，不能维持靶分子的存在比例，即 使统计性地解析得到的序列信息的频度，也不能得知所用的靶分子的比例，难 以应用于基因表达解析。

另外，各胶束的大小即容量依赖于胶束生成时的搅拌，因此其大小的变动 很大。故此，扩增反应时的试剂量变动，结果，得到的微珠上的扩增物的量也 有很大变动。因而，例如，在利用上述焦磷酸测序的解析中，每个微珠的信号 量大幅变动，因此存在检测系统的动态范围(dynamic range)不足，存在发生 由检测限以下或超出检测灵敏度引起的无法检测的事故这样的问题。

本发明的课题是解决这些现有技术的问题，提供高效率高精度的核酸扩增 用器件。

解决问题的手段

本发明人等，为了解决上述问题，想出了能够使直径数十微米以下的微小 微珠一个一个地反应、大规模的平行扩增用器件。

也就是说，本发明涉及核酸扩增用器件，作为一个例子，其为平面状配置 多个反应池的核酸扩增用器件，所述反应池具有1组能够保持1个第1微珠的 第1空间和与所述第1空间相对的第2空间，该核酸扩增用器件的特征在于， 按照使所述第1微珠不位于从所述平面状的面看时的所述第1空间和所述第2 空间不重叠的区域的方式来配置所述第1空间和所述第2空间。

某实施方式中，微珠保持空间(能够保持1个第1微珠的第1空间)和试 剂反应空间(相对的第2空间)直接上下连接。这时，相对于1微珠的直径r， 各空间的高度和直径满足以下条件，从而按照使1个微小反应池保持1个微珠 的方式来构成反应池(微小反应池)：