[发明专利]用于重组AAV2/8病毒载体生产的重组I型单纯疱疹病毒及其用途

说明书

本发明属于生物技术发明领域。具体涉及一种携带8型腺相关病毒(AAV8)外壳蛋白基因和AAV2病毒rep基因的重组单纯疱疹病毒HSV1-rep2cap8，以及用HSV1-rep2cap8制备AAV2/8病毒的方法。这种重组单纯疱疹病毒能提供AAV2ITR载体质粒在细胞内复制和包装成rAAV2/8毒粒所需的全部辅助功能，并能用于rAAV2/8的大量制备。HSV1-rep2cap8是通过对一套含有HSV1病毒全基因组的粘性质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)进行基因操作，将rep2cap8片段插入HSV1基因组的非必需基因中得到。

背景

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)因在腺病毒制品中发现而得名。腺伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科(parvovirus)成员，其基因组为4682个核苷酸组成的单链DNA。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”(ITR)，呈回纹-发卡结构。基因组中有两个大开放阅读框(ORF)，分别编码rep和cap基因。AAV-2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中。其中含有2个各145bp长的倒转末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)。它们是AAV基因组的复制起点，并与AAV复制、整合或包装等功能有关。其基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR种的末端解链位点trs(terminal resolutionsite)和GAGY重复基序(repeat motif)特异性结合，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能构成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1∶1∶20。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

AAV病毒载体因为安全性好、感染的宿主范围广泛、能稳定表达外源基因而成为有应用前景的病毒载体。AAV载体通常是用外源基因的表达单位(包括启动子、外源基因、mRNA加尾信号和/或其它调控元件)替代AAV病毒的repcap基因，保留两端的ITR，包装到AAV病毒颗粒中形成一种“假型病毒”(pseudotyped virus)。

产生rAAV病毒的最经典方法为将rAAV载体质粒与含有rep-cap基因的辅助质粒导入腺病毒或单纯疱疹病毒感染的细胞中。2-3天后从培养上清及病变的细胞中即可收获到rAAV病毒，同时还含有所用的腺病毒或单纯疱疹病毒。腺病毒和单纯疱疹病毒都可用热处理(55℃30分钟至2小时)而灭活，但不影响AAV病毒的活性。虽然这种生产rAAV病毒的方法比较简单，但仍存在许多明显的缺点。首先，每次制备rAAV病毒时都需要转染细胞。由于转染方法自身的限制，转染及共转染效率较低，是产生rAAV病毒滴度较低的原因之一。而且，用转染方法目前还难以大规模转导细胞，因此不适应大量生产rAAV病毒的需要。因此，有必要研究一种能用于大量生产rAAV病毒的系统和方法。