[发明专利]适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术

说明书

技术领域

本技术属于生物制药领域。涉及一种可满足人用禽流感裂解疫苗规模化生产的禽流感病毒纯化技术。

背景技术

禽流感病毒是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的，是各种家禽和野鸟的一种急性传染病。该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。1997年一株禽流感H5N1病毒在香港直接从禽传染给人造成18人感染，6人死亡，该事件说明由禽流感可以造成人流感流行。近几年禽流感在世界范围内有蔓延之势。亚洲近几年一直处于世界禽流感危机中心。据有关人员分析，禽流感的威胁将会持续很多年，卫生专家担心禽流感会和人流感病毒相结合，产生一种易于在人类间传播的疾病。2003年SARS夺走了近800人的生命，禽流感对人类健康的威胁远要比SARS严重许多。目前接种疫苗是预防疾病最有效、最经济的手段。

本发明的目标是研制一种安全有效的人用禽流感裂解疫苗，以预防可能造成的禽流感病毒在人群中的流行。

该发明是利用禽流感病毒反向遗传株NIBGR-14，建立主代种子及工作种子库，规模化、工业化在鸡胚细胞上进行病毒扩增，在此基础上对病毒进行纯化、裂解、灭活等一系列的工艺过程，再进行稀释、除菌过滤制成疫苗。

该发明技术主要是确认禽流感病毒纯化方法及纯化条件，建立具有独立知识产权的人用禽流感病毒裂解疫苗生产工艺。

禽流感疫苗是用禽流感病毒感染鸡胚，使病毒在鸡胚中生长繁殖，然后取其尿液，并经澄清、浓缩、纯化，把病毒提取分离出来，再制成疫苗。然而，由于鸡胚尿液中尿酸盐、蛋白含量很高，提取病毒十分困难。尤其在纯化前的澄清阶段，国内外许多实验室，想了很多办法，例如高速离心、红血球吸附、甲醇沉淀、磷酸铝吸附、聚乙二醇-6000沉淀等等方法，这些办法都不能令人十分满意。随着科学的发展和技术的提高，提取的方法也有了质的飞跃。如用凝胶层析法纯化病毒。

由于病毒液浓缩后粘稠度高，层析纯化方法需要经常清洗凝胶、装柱测柱效，且层析过程中需要使用大量的PBS缓冲液及碱液等。凝胶的使用寿命一般为1至2年。且大生产中新装的层析柱与使用一段时间的层析柱纯化的结果不同，因此批间差大、操作复杂、时间长、分离效果不均一，收率较低、成本高，易受其他条件影响。

蔗糖密度梯度法工艺流程简单，每批均使用新的蔗糖，因此批间差小、质量稳定、收率高、纯度很高，卵清蛋白含量很低，成本较低、疫苗的安全性更好，更适合于大规模疫苗的生产，从各项指标看后者均明显优于前者，因此我公司在制备人用禽流感病毒裂解疫苗时，采用蔗糖密度梯度法进行病毒的纯化。

该发明方法解决了规模化生产中禽流感病毒纯化技术，为大规模生产安全、有效的人用禽流感病毒裂解疫苗奠定了理论基础。

发明内容

该发明是要摸索禽流感病毒纯化方法及纯化条件，建立具有独立知识产权的人用禽流感病毒裂解疫苗生产纯化工艺。

为满足人用禽流感病毒裂解疫苗的生产需要，本发明选用符合疫苗生产的海兰白种蛋孵化的9-11日龄鸡胚，使用禽流感病毒工作种子，进行病毒的生产规模化扩增，收获病毒液。

在本发明方法中，我公司研究用的禽流感毒种为NIBRG-14(05/160)重配高产株，是由A/Vietnam/1194/2004(H5N1)毒株经重配获得，来自英国的NIBSC。

毒种传代和制备用鸡胚来源于无外源性禽白血病病毒、I型和III型禽腺病毒的SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚来源于封闭式房舍内饲养的、符合疫苗生产的海兰白或来亨健康鸡群。并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚。

本发明涉及一种规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒纯化方法，其特征在于：用300目滤布粗滤尿囊液去除杂质，再经8000rpm连续流低速离心方法去除大分子物质，对尿囊液澄清；选用100KD超滤膜，将病毒尿囊液超滤浓缩30-50倍；将病毒浓缩液经蔗糖密度梯度30000rpm离心3小时，对病毒进行纯化；根据紫外检测仪收集纯化后的病毒峰。

本发明的优点是：采用蔗糖密度梯度法工艺，其流程简单，每批均使用新的蔗糖，因此批间差小、质量稳定、收率高、纯度很高，卵清蛋白含量很低，成本较低、疫苗的安全性更好，更适合于大规模禽流感病毒裂解疫苗的生产，是唯一用于人用禽流感病毒裂解疫苗制备的方法。

附图说明

图1纯化的禽流感病毒SDS-PAGE电泳照片

图2禽流感病毒裂解疫苗生产流程图

具体实施方案：

1)鸡胚准备

选用血管清晰、胚胎活动的9～11日龄鸡胚。

2)病毒接种、培育及收获