[发明专利]一种重组人生长激素基因的杆状病毒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。 

背景技术

人生长激素(HGH，Human Growth Hormone)是一种由人体自身分泌的一种多肽，由191氨基酸残基组成的单链球状蛋白，分子量为22000道尔顿，由脑下垂体分泌出，经由下丘脑释放，主控生长发育、免疫和人体新陈代谢。HGH刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖，刺激软骨基质细胞增长，引起线性生长加速及骨骼变宽；调节生长激素不足或成人的脂肪、骨代谢、心肾功能，改善运动能力和生活质量。 

HGH对脂肪组织有促进脂肪分解而使血浆游离脂肪酸升高的作用；HGH可促进许多组织中RNA及蛋白质的合成，出现正氮平衡，使软骨、骨骼、肌肉结缔组织及内脏皆增长。生长激素通过血液运输到肝脏并刺激肝脏产生一种被称为类胰岛素生长因子的蛋白质分子(IGF-1)，增加软骨中胶原和其他蛋白质、硫酸软骨素、核酸合成的作用，从而促进软骨细胞的分裂和基质增生，促进骨骼和结缔组织的生长。除了这些促进生长的作用外，生长激素还参与机体的代谢调控，它在减少存储于脂肪细胞中的大量油脂、促进细胞内蛋白质分子的聚合、调控血糖水平方面都起着重要作用。因此生长激素对正在生长的机体的整体形态和机能有多方面的影响，在成人阶段也会继续发挥作用，在修复和维护机体不同组织的过程中充当着重要角色，但成年后其分泌随年龄增大而减少。人到达30岁后每十年间HGH分泌就以15％的速率递减，从而引起人体老化。尤其今日的生活环境里，各种压力、不良习惯及食物毒素所造成的危害，使得HGH分泌量迅速减少，人类更因此加速衰老。 

1920年，科学家发现生长激素。1958年，Herber Boyer潜心研究38年的HGH利用基因重组技术成功问世，并于当年获得诺贝尔生物学奖。1996年，美国FDA批准利用基因工程技术合成的HGH用于人体抗衰老。随着这种重组激素的大量出现，用生长激素治疗疾病成为可能，缺乏生长激素的儿童和成人现在可以通过补充生长激素来治疗。由于遭受某种疾病(如艾滋病)导致肌肉萎缩和身体虚弱的患者也可以从这种补充中获益。目前HGH在激素替代疗法中广泛使用，但因其在肠道极易代谢失去活性，市场上的HGH制剂主要是注射剂。 

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(smith，Mol CellBiol.，3：2156.2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。杆状病毒包括BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BssNPV、EOSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、UpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕、野蚕等。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕杆状病毒表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种重组杆状病毒及其制备方法以及其在制备重组HGH蛋白中的应用。 

本发明提供的重组杆状病毒，该病毒含有HGH基因，所述HGH基因序列见SEQ ID NO.1所示，此重组病毒可接种家蚕，表达重组HGH蛋白。当然，本发明的重组杆状病毒不仅可以接种家蚕，还可接种其它昆虫细胞。 

在一个具体实施方式中，本发明提供的重组杆状病毒为家蚕杆状病毒。利用本发明的家蚕杆状病毒接种家蚕，可获得家蚕生物反应器。该反应器可大规模生产，具有资源优势和成本优势。该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号为CGMCC No.2031，分类命名为家蚕核型多角体病毒Bombyx morinucleopolyhedrovirus，保藏日期为2007年4月28日。

一方面，本发明提供一种制备重组杆状病毒的方法，该方法包括：制备人生长激素HGH基因；将制备的含HGH基因的融合基因导入杆状病毒中，形成重组杆状病毒。在一个具体实施方式中，本发明提供制备重组杆状病毒的方法，是通过PCR扩增人生长激素HGH基因，经酶切后导入转移载体获得重组转移载体。然后使该重组转移载体与线性化杆状病毒同源重组，将外源基因插入杆状病毒中，得到含有HGH基因的重组杆状病毒。