[发明专利]一种羰酰还原酶在生产(S)－4－氯－3羟基丁酸乙酯中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种羰酰还原酶的应用，尤其涉及一种羰酰还原酶 (Ccarbonyl Rreductase CR)在以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物不对称还原反应生产(S)-4-氯-3羟 基丁酸乙酯中的应用。

背景技术

(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate，(S)-CHBE)是一种 重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰 CoA(HMG—CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。

以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl COBE)作为还原反应的潜手性底物， 易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效 的制备途径。

迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括 起来主要有化学法和生物法。

化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂的贵铑、釕等金属，采用化学法合 成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗 能高，污染大。

微生物法分为酶催化和全细胞催化法，Shimizu等用来自Sporobolomyces salmonicolor AKU4429的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系[2]和水/有 机溶剂两相体系[3]催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应所用的 酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相比， 应用较少。全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S)－CHBE两种， Yasohaura等[4]从400株酵母菌中筛选得到了一株Candida magnoliae，在水/乙酸正丁 酯体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的 条件下产物(S)-CHBE在有机相的积累浓度可达90g/L，产物的光学纯度对映体过 量值(enantiomeric excess e.e)达到96％。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化 COBE为不同构型CHBE的还原酶，因此采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活 性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着 重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。Yasohara等[5] 从木兰假丝酵母菌Candida magnoliae中分离得到了一个辅酶NADPH依赖型的羰基还 原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定时添加适量的辅酶 NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE的不对称还原(S)-CHBE，其 得率和光学纯度分别为85％和100％e.e.[6]。

综上所述，现有催化COBE为(S)-CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性底、 成本高等问题。

本专利中涉及到的还原酶是羰酰还原酶的一种，其包含282个氨基酸，其在Genbank 中的收录号为XP_001387287，(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb＝protein&id＝

126273732)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码该蛋白的基因含有849bp碱 基，其在Genbank中的收录号为XM_001387250，(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fegival＝XM_001387250.1)，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。至今未发现该 羰酰还原酶用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE的报道。

【参考文献】：