[发明专利]一种氨基糖苷类药物通用人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种氨基糖苷类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

新霉胺，英文名称：Neamin，CAS号5144-52-5，分子式为C₁₂H₂₅N₄O₆，俗称新霉素A，是氨基糖苷类药物的结构共同体。氨基糖苷类药物是一类由氨基糖分子和非糖部分的糖元结合而成的抗生素。该类抗生素应用广泛，是进行治疗药物监测的广谱抗生素。其作用特点是能够与核糖体30S亚单位结合，导致其合成异常蛋白，阻碍易合成蛋白的释放，从而抑制细菌的生长。临床上氨基糖苷类抗生素主要用来治疗大肠杆菌引起的肠道感染、细菌性痢疾、皮肤粘膜感染以及眼部感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对氨基糖苷类抗生素进行快速、准确、多残留的检测。目前国内外尚未有理想的针对氨基糖苷类药物多残留免疫检测方法的报道。为了弥补这一空白，设计了以氨基糖苷类抗生素的结构共同体新霉胺为半抗原的合成氨基糖苷类药物免疫检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种氨基糖苷类药物通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于氨基糖苷类抗生素的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种氨基糖苷类药物的通用人工抗原的合成方法，以新霉胺为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比；

(1)人工抗原的合成：控制新霉胺、戊二醛、牛血清白蛋白以摩尔比为150∶35∶1的比例反应，首先让半抗原新霉胺与牛血清白蛋白溶于0.1mol/L碳酸钠缓冲液室温混匀，逐滴加入现配的1％的戊二醛水溶液，温和搅拌反应15分钟后，反应液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/mL，然后置4℃下温孵1.5小时，即得人工抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：7-新霉胺-牛血清蛋白；

(2)人工抗原的鉴定：人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白的分子量增加来确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

本发明的有益效果：本发明成功合成了新霉胺的人工抗原，被用作一种氨基糖苷类药物通用人工抗原，合成步骤简洁，有效，可完全用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对氨基糖苷类药物研究的需要。

附图说明

图1低分子量标准蛋白Mark、牛血清蛋白BSA及其偶联物的凝胶电泳图。A：低分子量标准蛋白Mark，B：新霉胺人工抗原，C：牛血清蛋白BSA。

图2电泳标准曲线图(lgMW-Rf图)。

具体实施方式

实施例1

(1)人工抗原的制备

15mg新霉胺、20mg牛血清蛋白BSA溶于10mL 0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH7.3、含有0.15mol/L NaCl)，逐滴加入现配的质量浓度1％的戊二醛水溶液1.0mL，温和搅拌15分钟后，反应液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/mL，然后置4℃下温孵1.5小时，即得人工抗原混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。