[发明专利]一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法，尤指采用ELISA方法检测非洲马瘟病毒抗体的抗原制备、纯化，检测试剂盒和方法，不仅适用于感染后对马科动物血清中的非洲马瘟病毒抗体进行检测，也适用于非洲马瘟病毒疫苗免疫后的抗体评价，属于动物检验检疫领域。

背景技术

非洲马瘟(African horse sickness，AHS)是马科动物的一种由节肢动物传播的非接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国也将其列为一类重大动物疫病。病原为非洲马瘟病毒(AHSV)，该病原属于呼肠孤病毒科环状病毒属(Orbivirusgenus，Reoviridae)。环状病毒属不同的血清群可根据主要的群特异性抗原VP7的抗原性来鉴别。对于易感马群，感染本病后致死率可达95％。以呼吸系统和循环系统的病理变化为特征；骡的易感性稍差，而驴感染后很少发生死亡。斑马感染后通常不出现症状，可成为自然贮存宿主携带和传播病原。病原的传播媒介为Cullicoides species。本病在非洲的撒哈拉地区呈地方流行，呈季节性发生，但历史上本病在摩洛哥(1992)，中东(1960)和欧洲(1992)的暴发给马业造成了巨大的经济损失。由于本病的巨大破坏性，在国际上进行马的运输过程中，尤其是在无AHS的地区，应执行严格的兽医卫生措施。南非在控制AHS时，主要采用给易感动物接种多价活疫苗的免疫措施，并定期进行检测。

目前已发现非洲马瘟病毒具有9个血清型。与环状病毒的原型病毒——蓝舌病(BTV)相似，非洲马瘟病毒没有囊膜，具有3层呈二十面体对称的衣壳。病毒基因组包含10个dsRNA片段，编码10种蛋白，其中的7种为结构蛋白和4种非结构蛋白。病毒粒子的外衣壳由VP2和VP5组成，内衣壳由VP3和VP7组成，其中VP7为主要的内衣壳蛋白，在9个血清型的病毒中最为保守，为群特异性抗原蛋白。

对AHSV感染马匹和免疫接种马匹进行快速的实验室评价对决定是否对马匹进行运输极为重要。病毒分离鉴定是对本病进行准确诊断的传统方法，但病毒分离鉴定费时费力，且需要一定的工作经验。传统的血清学诊断方法包括琼脂扩散试验(AGID)，补体结合试验(CF)以及病毒中和试验(VN)。但VN相当繁琐，而且需要有标准的参考毒株，特定型的血清，因此目前很少采用该方法，只有较少的国际参考实验室采用此方法。目前广泛采用CF检测AHS群特异性抗体，而且该方法也是(OfficeInternational des Epizooties，OIE)推荐的在国际贸易中使用的方法，但改方法同样需要标准化的抗原和血清，而且方法相对繁琐，不适于大批量血清的筛查。而检测群特异性抗体的ELISA方法和快速的核酸检测方法有望解决这些问题。

目前已有一些研究致力于建立可检测AHSV和其抗体的ELISA方法，大多数用于检测AHSV抗原的ELISA方法使用哺乳动物的多抗，单抗或禽源抗体。而抗体检测方法主要采用纯化病毒制备抗原的方法。同重组抗原方法相比，纯化等量的全病毒或病毒亚单位相对更为耗时和昂贵。VP7抗原稳定而且不具有感染性，适合于作为ELISA检测的抗原。Sonja Mareea等于2005采用昆虫细胞表达的VP7蛋白建立了ELISA检测方法，但目前尚未有采用原核表达的重组蛋白建立ELISA检测方法。

目前已报道的采用可溶性或重组抗原建立的ELISA方法尚有一些缺点：抗原制备费时且昂贵；抗原的特异性评价不充分等。

为进一步建立能满足国际贸易需求的标准化检测试剂，我们开展了本研究。本研究利用IPTG对含有VP7蛋白抗原域的原核表达载体pET-30a-VP7进行诱导表达，结果得到了目的融合蛋白，经包涵体的洗涤、溶解和复性，获得较高纯度的目的蛋白，同时，通过方阵滴定初步建立了检测AHSV抗体的间接ELISA方法，并对临床样品进行了检测，为试剂盒的标准化和商品化奠定基础。

本发明首次采用原核表达的重组蛋白应用于非洲马瘟病毒抗体的检测，制备纯化了重组蛋白，建立了间接ELISA检测方法，研制出了检测试剂盒。

发明内容

本发明的要解决的第一个技术问题是人工拼接一段含有非洲马瘟病毒VP7蛋白大多数线性表位的核酸片段，并实现其高效表达。

本发明要解决的另一个技术问题是将表达的重组蛋白纯化，作为包被抗原，建立重组间接ELISA方法。

本发明要解决的第三个技术问题是研制出重组间接ELISA检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：