[发明专利]一种利用盾叶薯蓣内生镰孢菌寡糖提高培养细胞薯蓣皂苷元产率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种促进盾叶薯蓣培养细胞生长和提高薯蓣皂苷元产率的方法，特别是涉及一种生产活性寡糖的微生物-盾叶薯蓣内生镰孢菌。

背景技术

采用植物细胞培养的方法可以大规模生产次生代谢产物，这些次生代谢产物可用作农药、医药、化妆品、食品添加剂等。如何有效提高培养细胞中有用代谢产物的含量和产率，是植物次生代谢产物生产走向工业化生产的一个重要方面。有许多手段能有效地促进植物细胞生长和提高植物培养细胞中次生代谢产物的含量，如添加前体物质、改变营养条件、各种机械或物理的诱导作用、各种化学物质的调节等，其中采用来自植物或微生物的寡糖诱导子是一种有效的手段。许多人工合成或由多糖裂解而来的寡糖(oligosaccharide)(或称寡糖片段)具有促进植物生长发育、细胞形态建成、提高次生代谢产物含量和提高植物的抗病性等多种生物活性。已有许多从真菌和植物中获得寡糖的报道，但尚未见从植物内生真菌中获得活性寡糖来影响宿主植物次生代谢的报道。

盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)在分类上属于单子叶纲(Monocotyledoneae)百合目(Liliales)薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属，为我国特有的药用植物，分布于湖南、湖北、四川、甘肃等省区。盾叶薯蓣根状茎中含有多种内生真菌，它们与宿主植物长期互惠共存，相互影响，协同进化。

本发明着重于盾叶薯蓣内生真菌寡糖的制备及其在细胞培养中提高薯蓣皂苷元产率方面的应用，为新型诱导子的开发和探讨内生真菌与宿主之间的相互关系提供依据。

发明内容

本发明涉及一种镰孢菌(Fusarium sp.)，菌株代号为Dzf17，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为2472。本发明涉及镰孢菌的分离和分类鉴定、真菌寡糖的制备，以及真菌寡糖对盾叶薯蓣培养细胞生长和薯蓣皂苷元形成的影响，有效提高薯蓣皂苷元的产率，提供如下的技术方法。

1、内生镰孢菌Dzf17的分离

采集新鲜的盾叶薯蓣根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Dzf17。

2、内生镰孢菌Dzf17的形态特征

(1)无性世代：内生真菌Dzf17菌株在PDA培养基上25℃培养，菌落白色夹杂紫色，圆形，产生大量紫色色素，分生孢子梗单生或轮生，瓶梗状，大孢子近镰刀形，2～3个隔，小孢子卵圆形，椭圆形，肾形无隔～1个隔，孢子大小4.8μm～22.8μm×2.3μm～5.0μm。内生真菌Dzf17的形态特征(见图1、图2、图3和图4)符合镰孢菌属(Fusarium)真菌的形态特征。

(2)有性世代：未发现。

3、内生镰孢菌Dzf17的分子生物学特征

运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。将Dzf17菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accession number)EU543260。同时将Dzf17菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Dzf17菌株的ITS序列与尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)EF495237的ITS序列相似度为100％，聚在一个分支上的可信度为100％。其同源性的系统发育树图见图5。

4、内生镰孢菌Dzf17的发酵培养特征

培养基：液体马铃薯-葡萄糖(PD)培养基。

培养温度：25±1℃。

是否光照：否。

培养时间：14天。

摇床转速：150rpm。

培养特征：培养第6天，菌液略带淡紫色；培养第14天，菌液为黄白色。

5、内生镰孢菌Dzf17多糖和寡糖的制备

Dzf17菌丝多糖：含量为224.56mg/g dw，得率为2.785g/L；菌丝寡糖：含量为56.25mg/g dw，得率为：0.698g/L；菌液多糖得率为：0.625g/L；菌液寡糖得率为：0.124g/L。

6、盾叶薯蓣细胞悬浮培养特征

培养基：MS培养基。

培养温度：25±1℃。

是否光照：否。

培养时间：16天～26天不等。

摇床转速：120rpm。