[发明专利]一种从鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的方法

权利要求书

1、一种从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是包含如下步骤：

(1)、粉碎：取鲜鹿茸，在低温下粉碎，温度4-10℃，过80目筛；

(2)、超声波提取：将粉碎后的鹿茸用体积/重量为3-10倍的pH9-12的缓冲液进行提取，优选pH10的缓冲液，优选5-9倍，最优选7倍；温度4-30℃，优选10-25℃，最优选20℃；时间10-60min，优选15-30min，最优选15-20min；提取1-2次；

(3)、高速离心分离：提取液于高速离心机中5000-10000转离心20min，沉淀部分加入2-5倍的缓冲液，重复上述操作，合并两次离心所得上清液；

(4)、超滤：将上清液用膜进行超滤，去除小分子物质和大分子物质，并对上清液进行浓缩，得浓缩液，膜的截留值为1-100kDa，优选6-20kDa；

(5)、离子交换层析：将超滤上清液调pH至5-7，优选6.8，上阳离子交换柱，梯度洗脱，先用pH5-7，优选6.8，的缓冲液洗脱，优选磷酸盐缓冲液，再用含0.4-0.6mol/l(优选0.5mol/l)的NaCl的pH5-7(优选pH6.8)缓冲溶液(优选磷酸盐缓冲液)，再用含0.7-0.9mol/lNaCl(优选0.8mol/l)的pH 7-8(优选pH7.6)缓冲溶液(优选磷酸盐缓冲液)梯度洗脱，再用含0.9-1.1mol/l的NaCl(优选1.0mol/l)的pH 8-10(优选9.0)缓冲溶液(优选Tris-HCl缓冲液)梯度洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰；离子交换层析柱优选CM Sephadex C-50柱；

(6)、超滤：用1-100kDa(优选2-6kDa)的超滤膜将步骤(5)得到的胰岛素样生长因子-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；

(7)、冷冻干燥：将步骤(6)所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉。

2、一种如权利要求1所述从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是还包含如下步骤：

(8)、凝胶色谱纯化：将步骤(6)所得浓缩液，或者步骤(7)所得到的冻干粉溶于pH8-10缓冲溶液中，优选9.0，上凝胶排阻色谱柱，以pH 8-10优选9.0缓冲溶液(优选Tris-HCl缓冲液)洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰，凝胶排阻色谱柱优选Sephadex G-50；

(9)、超滤：用1k-100kDa(优选2-6kDa)的超滤膜将步骤(8)得到的胰岛素样生长因子IGF-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；

(10)、冷冻干燥：将步骤9所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；冻干粉中IGF-1纯度可达98％以上，满足药品原料的要求。

3、一种如权利要求1、2所述从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是包含如下步骤：

(1)、粉碎：取鲜鹿茸，在低温下粉碎，温度4-10℃，过80目筛；

(2)、超声波提取：将粉碎后的鹿茸用体积/重量为7倍的pH10的缓冲液进行提取，；温度20℃；时间15-20min；提取2次；

(3)、高速离心分离：提取液于高速离心机中5000-10000转离心20min，沉淀部分加入2-5倍的缓冲液，重复上述操作，合并两次离心所得上清液；

(4)、超滤：将上清液用膜进行超滤，去除小分子物质和大分子物质，并对上清液进行浓缩，得浓缩液，膜的截留值为6-20kDa；

(5)、离子交换层析：将超滤上清液调pH至6.8，上阳离子交换柱，梯度洗脱，先用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.5mol/l的NaCl的pH6.8磷酸盐缓冲溶液洗脱，再用含0.8mol/lNaCl的pH7.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用含1.0mol/l的NaCl的pH 9.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰；离子交换层析柱为CM Sephadex C-50柱；

(6)、超滤：用6-20kDa的超滤膜将步骤(5)得到的胰岛素样生长因子-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；

(7)、冷冻干燥：将步骤(6)所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；

(8)、凝胶色谱纯化：将步骤(6)所得浓缩液，或者步骤(7)所得到的冻干粉溶于pH9.0Tris-HCl缓冲溶液中，上凝胶排阻色谱柱，以pH 9.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集胰岛素样生长因子-1的峰，凝胶排阻色谱柱为Sephadex G-50；

(9)、超滤：用2-6kDa的超滤膜将步骤(8)得到的胰岛素样生长因子IGF-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；

(10)、冷冻干燥：将步骤9所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；冻干粉中IGF-1纯度可达98％以上，满足药品原料的要求。